陳 冉, 王應(yīng)利, 周玉梅, 陶 俊, 靳揚揚

0引言

我國2013年糖尿病的發(fā)病率為11.6%，糖尿病患者1.139億，是世界糖尿病患者最多的國家[1]。我國DR、NPDR和PDR在糖尿病人群中的發(fā)病率分別是23.0%、19.1%和2.8%，且DR的患病率還在逐年增加，致盲率也逐年升高，因此制定DR的篩查和治療方案成為當(dāng)務(wù)之急[2]。很多生物標(biāo)志物參與了DR的發(fā)生和進展，傳統(tǒng)的標(biāo)記物有血糖、血壓、血脂、體質(zhì)量指數(shù)、氧化應(yīng)激等相關(guān)因子，更多的新型標(biāo)記物有糖基化終產(chǎn)物、炎性因子、血管生成因子、血管調(diào)節(jié)因子等[3-4]。PDGF-BB因其在視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜新生血管中的作用日益受到重視，它能夠促進視網(wǎng)膜內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、分化和遷移，加強對周細(xì)胞的募集，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、移行等影響視網(wǎng)膜新生血管的成熟[5]。但目前PDGF-BB與糖尿病視網(wǎng)膜病變是否直接相關(guān)少見報道。本研究測定血清中PDGF-BB的質(zhì)量濃度，觀察其與2型糖尿病患者DR的相關(guān)關(guān)系，探索它能否作為DR的生物標(biāo)記物。

圖1 NPDR患者，張某某，女，56歲，血清PDGF-BB濃度：471.385pg/mL A、B：分別示右、左眼彩色眼底圖；C、D：分別示右、左眼FFA圖，可見微動脈瘤及毛細(xì)血管滲漏；E、F：分別示右、左眼OCT圖，未見黃斑水腫。

圖2 PDR患者，李某某，男，64歲，血清PDGF-BB濃度：594.0684pg/mL A、B：分別示右、左眼彩色眼底圖，可見全視網(wǎng)膜點片狀出血及黃白色硬性滲出；C、D：分別示右、左眼FFA圖，可見后極部微動脈瘤、無灌注區(qū)、視盤新生血管、視網(wǎng)膜新生血管；E、F：分別示右、左眼OCT圖，可見黃斑水腫及硬性滲出。

1對象和方法

1.1對象納入2017-11/2018-10于應(yīng)急總醫(yī)院就診的2型糖尿病患者75例，健康體檢者75例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2010年美國糖尿病協(xié)會(ADA)頒布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病患者；(2)檢查時配合良好；(3)所得OCT、彩色眼底照相及眼底熒光血管造影圖像清晰。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在除高血壓、糖尿病以外的其他系統(tǒng)疾病者(患者通過心電圖、超聲心動圖、胸片、腹部B超等排除系統(tǒng)病變)；(2)有內(nèi)眼手術(shù)史及視網(wǎng)膜激光光凝治療史；(3)伴有青光眼、虹睫炎等其它嚴(yán)重眼部疾病者；(4)具有可能影響黃斑厚度的其他眼底病者；(5)資料不全或不能配合檢查者。本項研究遵循《赫爾辛基宣言》，受檢者均簽署知情同意書，并通過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1采集血清標(biāo)本抽取清晨空腹靜脈血5mL，其中3mL靜脈血用于測定空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋自(HDL)等生化指標(biāo)，另2mL靜脈血以3 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min后，取其血清置于-50℃冰箱中凍存。

1.2.2分組將患者根據(jù)2014年《我國糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南》DR的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[2]進行分組：(1)患2型糖尿病但無糖尿病視網(wǎng)膜病變者組(NDR組)25例；(2)非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變組(NPDR組)25例；(3)增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變組(PDR組)25例。對照組選取同期應(yīng)急總醫(yī)院的健康體檢者75例。四組研究對象近6mo內(nèi)無感染性疾病史，且性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)相匹配。

1.2.3 PDGF-BB質(zhì)量濃度測定采用人PDGF-BB ELISA檢測試劑盒，ELISA法對血清中的PDGF-BB質(zhì)量濃度進行測定。取出血清標(biāo)本，室溫下靜置解凍，30min內(nèi)檢測，根據(jù)試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)，測定各孔吸光度(OD)值，根據(jù)定比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出標(biāo)本中PDGF-BB的質(zhì)量濃度。

1.2.4數(shù)據(jù)收集由同一組經(jīng)驗豐富的醫(yī)生收集數(shù)據(jù)，包括最佳矯正視力(BCVA)、眼底檢查，彩色眼底照相，OCT及眼底熒光血管造影檢查。由OCT多功能影像診斷平臺掃描生成黃斑區(qū)視網(wǎng)膜厚度地形圖，并測量以黃斑中心為圓心，直徑4mm圓形范圍內(nèi)的9個區(qū)域視網(wǎng)膜厚度值，取其平均值為黃斑中心厚度(central subfield macular thickness，CSMT)[6]。

統(tǒng)計學(xué)分析：使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS24.0進行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)檢驗所測數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達。血清中PDGF-BB濃度與高血壓、糖尿病病程、各項生化指標(biāo)相關(guān)性用多元線性回歸分析。各組間血清中PDGF-BB濃度的比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩組間比較采用LSD-t法進行多重比較。各組PDGF-BB濃度與CSMT的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析,雙側(cè)P<0.05則差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1研究對象的一般資料研究對象近15d內(nèi)均未患感染性疾病，按前述方法分為四組。NPDR組和PDR組典型病例圖片見圖1、2。四組研究對象年齡、性別、BMI相匹配，基本情況見表1。

2.2各組生化指標(biāo)及病程的比較糖尿病組與對照組FPG、HbA1c、TC、TG、LDL、HDL、高血壓病程、糖尿病病程的水平比較見表2。各組間TC、TG、HDL、LDL、高血壓病程差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NDR組、NPDR組、PDR組的糖尿病病程、FPG、HbA1c均高于對照組(P<0.05)，且NDR組

表1 各組研究對象基本情況

表2 各組生化指標(biāo)及病程的比較

表3 各組血清PDGF-BB濃度與CSMT的相關(guān)性分析

2.3血清PDGF-BB濃度與各項指標(biāo)相關(guān)性分析血清PDGF-BB濃度與各項指標(biāo)的多元回歸分析模型結(jié)果可信(R2=0.656)，結(jié)果顯示：血清PDGF-BB濃度與FPG、TG、糖尿病病程有相關(guān)性(P=0.045、0.002、<0.01)，與HbA1c、TC、高血壓病程、HDL、LDL均無相關(guān)性(P=0.800、0.626、0.571、0.736、0.342)。

2.4各組血清PDGF-BB濃度比較對照組、NDR組、NPDR組、PDR組四組血清PDGF-BB濃度分別為400.28±44.55、409.65±50.37、535.67±69.21、551.60±103.46pg/mL，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.259，P<0.01)。進一步采用LSD-t多重比較發(fā)現(xiàn)，對照組和NDR組PDGF-BB濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.288,P=0.774)，NPDR組和PDR組PDGF-BB濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.569,P=0.572)。對照組和NPDR組PDGF-BB濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.28,P<0.01)。對照組和PDR組PDGF-BB濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.59,P<0.01)。NDR組和NPDR組PDGF-BB濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.61,P<0.01)。NDR組和PDR組PDGF-BB濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.91,P<0.01)。血清PDGF-BB濃度比較：PDR組、NPDR組>NDR組、對照組。

2.5各組血清中PDGF-BB濃度與CSMT的相關(guān)性分析各組血清PDGF-BB濃度與CSMT采用Pearson相關(guān)性分析顯示：PDR組血清PDGF-BB濃度與CSMT存在相關(guān)性(r=0.613，P=0.017)，對照組、NDR組、NPDR組血清PDGF-BB濃度與CSMT不存在相關(guān)性(r=0.013、0.051、0.062，P=0.732、0.771、0.108)，見表3。

3討論

本研究檢測了2型糖尿病患者不同DR病程及對照組血清PDGF-BB水平，發(fā)現(xiàn)四組血清PDGF-BB濃度組間存在顯著性差異(F=14.259，P<0.01)。PDR患者血清中PDGF-BB水平高于NDR患者及對照組，且黃斑水腫程度與PDGF-BB水平正相關(guān)。說明隨著DR疾病程度的加重，血清PDGF-BB水平升高，血清PDGF-BB水平或許可以作為反映DR程度的血清標(biāo)記物。既往動物實驗表明，2型糖尿病的遺傳模型Goto-Kakizaki(GK)大鼠在7mo時血清中PDGF-BB含量開始升高，說明其可能參與了GK大鼠糖尿病的發(fā)生發(fā)展[7]。而易如海等[8]在大鼠DR模型中的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在NDR期視網(wǎng)膜PDGF-BB的表達已顯著增加，隨著病程延長PDGF-BB的表達進一步增加，和我們的結(jié)果略有區(qū)別?？赡苁且驗镈M早期血-視網(wǎng)膜屏障尚未破壞，視網(wǎng)膜中的PDGF-BB尚未影響到血清。Anna等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)NPDR患者玻璃體液中的PDGF-BB含量較非糖尿病對照組顯著下調(diào)，而我們的結(jié)果顯示NPDR患者血清中PDGF-BB濃度高于正常對照組，這可能是因為隨著病情的進展，NPDR期患者的血-視網(wǎng)膜屏障破壞，NDR期形成的PDGF-BB進入血液中，導(dǎo)致血清中PDGF-BB濃度增加，但NPDR期由于高血糖應(yīng)激，視網(wǎng)膜PDGF-B表達受到抑制，玻璃體液中的PDGF-BB含量減少。Annie等發(fā)現(xiàn)PDGF-BB在PDR患者的玻璃體中持續(xù)增加，與我們的結(jié)果一致[10]。可能因PDGF-BB表達在NPDR期被抑制，使其對周細(xì)胞保護和調(diào)控作用下降，導(dǎo)致周細(xì)胞增殖減少而凋亡增加，加劇了視網(wǎng)膜微血管損傷，隨著病程由NPDR向PDR進展，機體對高血糖的耐受，PDGF-BB的表達代償性增加，進而形成視網(wǎng)膜新生血管。因此可以推斷，PDGF-BB在NPDR和PDR階段可能起不同作用。

本項研究中，血清PDGF-BB濃度僅與PDR組黃斑厚度相關(guān)，與NPDR組黃斑厚度無相關(guān)性。我們知道，隨著DR病情的加重，進入增殖期的患者發(fā)生黃斑水腫的機率更大，程度更重。最近，Cacciamani等[11]通過蛋白芯片、western blot、ELISA等方法檢測了30例糖尿病黃斑水腫患者玻璃體液中眾多與炎癥和血管生成有關(guān)的生物標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)除了眾所周知的VEGF外，還有骨橋蛋白、白介素-6等生物標(biāo)記物水平與黃斑水腫程度相關(guān)。我們的研究是對PDGF-BB作為糖尿病黃斑水腫的生物標(biāo)記物，還需要多中心大樣本檢測。既往的試驗是用OCT掃描生成黃斑視網(wǎng)膜地形圖，取黃斑中心為圓心，直徑1mm圓形范圍內(nèi)的128個視網(wǎng)膜厚度值為CSMT[6]，本試驗將測量范圍擴大到直徑4mm圓形范圍內(nèi)，并取黃斑區(qū)視網(wǎng)膜地形圖中9個區(qū)域視網(wǎng)膜平均厚度值為CSMT，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。本試驗觀察到血清中PDGF-BB濃度與FPG具有相關(guān)性，以往的研究也已證實，體內(nèi)高血糖水平會通過激活蛋白激酶C信號通路促進血管內(nèi)皮細(xì)胞中PDGF-BB和PDGFR-β的表達[12]。本研究發(fā)現(xiàn)血清中PDGF-BB濃度與TG具有相關(guān)性，目前普遍認(rèn)為嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝異常，不僅直接損傷細(xì)胞，還會導(dǎo)致PDGF-BB的高表達[13]，與本試驗相符。Sahar等發(fā)現(xiàn)糖尿病患者尿PDGF-BB與糖尿病病程正相關(guān)[12]，我們的結(jié)果顯示患者血清中PDGF-BB濃度與糖尿病病程具有相關(guān)性，可能是由于隨著糖尿病病程的遷延，患者血清中PDGF-BB含量增加導(dǎo)致隨尿液排出的PDGF-BB含量增加。本研究發(fā)現(xiàn)血清中PDGF-BB水平與HbA1c、TC、HDL、LDL、高血壓病程無相關(guān)性，與Yang等[14]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，隨著糖尿病病程的發(fā)展，患者從發(fā)生DR開始血清中PDGF-BB濃度明顯升高，當(dāng)進入增殖期時患者血清中PDGF-BB濃度與黃斑水腫存在明顯正相關(guān)，提示PDGF-BB可以做為監(jiān)測糖尿病病程進展的生物標(biāo)志物。但本試驗為橫斷面研究，無法建立因果聯(lián)系，且DM患者血清中PDGF-BB濃度受全身因素影響較大，與DR的關(guān)聯(lián)性需要增大樣本量進一步確認(rèn)，并且需要深入探索DM患者血清中PDGF-BB的來源、影響因素以及對DR病情發(fā)展的作用。