魏琪，陳品澔，楊瀅，李佳妮

（西安培華學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710125）

皮膚是機(jī)體的第一道防線，當(dāng)皮膚創(chuàng)傷、燒傷等后面臨著皮膚創(chuàng)面的修復(fù)，包括止血、消炎、細(xì)胞增殖和遷移等[1]，而傳統(tǒng)的生物敷料比如紗布僅僅保護(hù)傷口、暫時止血的作用，顯然已達(dá)不到社會的需求。近些年，研究者們往往在生物敷料中融合一些生長因子用于缺損修復(fù)[2]，bFGF在眾生長因子中研究相對比較深入。Shuichi Ogino等[3]將bFGF注入cgs（膠原蛋白/明膠海綿），植入小鼠背部的全厚皮膚缺陷，結(jié)果顯示促進(jìn)了真皮樣組織的形成；Sakamoto等[4]利用1%的戊二醛交聯(lián)明膠與bFGF，并將交聯(lián)液作用于小鼠的缺損皮膚，結(jié)果表明交聯(lián)液有效地促進(jìn)小鼠缺損皮膚的修復(fù)。在眾多敷料材料中，絲素蛋白作為天然結(jié)構(gòu)蛋白，有利于細(xì)胞貼附和伸展，易提取且提取量大等優(yōu)點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受青睞[5]。比如，Tony M. D等通過J將絲素蛋白與神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor,NGF）、睫狀神經(jīng)生長因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）共紡形成納米纖維膜，卷曲形成3D支架，將大鼠的原代神經(jīng)細(xì)胞種植其上，突起的長度明顯增長?？梢姡z素蛋白材料可被設(shè)計并融合生長因子用于皮膚缺損的修復(fù)。2016年，筆者將ELP50-bFGF（類彈性蛋白ELP50與bFGF的融合蛋白）與絲素蛋白按比例凍干形成復(fù)合膜片用于小鼠皮膚缺損的修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合膜片中bFGF并未表現(xiàn)出活性，可能ELP50的結(jié)構(gòu)影響了bFGF的結(jié)構(gòu)使其失活。因此，本實(shí)驗擬改進(jìn)方法通過靜電紡絲制備SF/bFGF納米纖維膜，以期促進(jìn)皮膚缺損的修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

4周齡的昆明小鼠，由西安培華學(xué)院中心實(shí)驗室提供。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉（Sigma）、BCATM蛋白檢測試劑盒（Thermo）、胰酶（Hyclone）、DMEM（Gibco）、非必需氨基酸（Hyclone）、PBS（Hyclone）、胎牛血清（FBS,Gibco）、Na2S（天津天力），其他試劑均為分析純試劑。

1.3 儀器

冷凍式干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司）、倒置顯微鏡（NikonBinder）、真空干燥箱（Vacucell 22L, MMM）、掃描電子顯微鏡（SEM，飛利浦）、超凈臺（海爾）等。

1.4 實(shí)驗方法

（1）絲素蛋白的制備。切割蠶繭，干燥并稱重10 g，置于含有2 L Na2CO3（濃度0.05 mol/L）水溶液的鍋中，脫膠30 min，蒸餾水多次洗滌，脫膠反復(fù)進(jìn)行3次后在100 ℃烘箱中烘干，用9.3 mol/L LiBr在80℃水浴中溶解絲素蛋白，以轉(zhuǎn)速為10 000 r/min的速度離心10 min用于除去懸浮雜質(zhì)，最后裝入透析袋透析3 d，凍干機(jī)凍干保存。

（2）SF/bFGF納米纖維膜的制備。將SF凍干品加入雙蒸水配成濃度為25%的溶液，加入bFGF，使bFGF的濃度為10 μg/mL，設(shè)置距接收屏的距離為7 cm及電壓為20 kV/cm，進(jìn)行靜電紡絲獲得SF/bFGF納米纖維膜。

（3）遷移實(shí)驗。使用無菌的12孔板，用記號筆在每個孔背面均勻的畫線，向每個孔中各放入一個蓋玻片后各加入1 mL混合蛋白溶液（bFGF的濃度為10 μg/mL，SF的濃度為25%）進(jìn)行包被。次日，向每個孔內(nèi)各種5×105個L929細(xì)胞，等細(xì)胞長滿整個孔后用槍頭沿著記號筆的橫線劃痕，在0 d和3 d，借助顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)并觀察遷移的數(shù)量和距離。實(shí)驗過程中，各孔加入等量PBS組作為陰性對照組。

（4）昆明小鼠皮膚缺損修復(fù)實(shí)驗使用麻醉劑戊巴比妥鈉事先麻醉小鼠，脫毛劑脫毛后，在背部中央消毒部位制造直徑約1.2 cm的圓形缺損，將直徑也為1.2 cm的SF/bFGF納米纖維膜和SF膜各貼于昆明小鼠皮膚缺損部位，無貼附組即con組，每組包含6只小鼠，每天采照并計算傷口的愈合面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合膜片的形態(tài)結(jié)構(gòu)

SF和bFGF混合溶液靜電紡絲得到的纖維如圖1所示，設(shè)置濃度SF為25%，bFGF為10 μg/mL、距接收屏的距離為7 cm及電壓為20 kV/cm，纖維形貌比較均一和規(guī)則，粗細(xì)相對一致，可見少量串珠和液滴的存在。

圖1 靜電紡絲納米纖維膜形態(tài)

2.2 SF/bFGF對L929遷移能力的影響

L929遷移結(jié)果如圖2所示，0d時，L929剛好長滿各孔，長勢優(yōu)良且形狀如長梭，劃痕區(qū)都可見少量L929；3 d時，SF/bFGF組比對照組有更多的L929從劃痕區(qū)外遷至劃痕區(qū)內(nèi)且距離也較長，此時各孔L929長勢稍弱，細(xì)胞中央漸漸突起，導(dǎo)致形狀由長梭漸漸變成短梭。

圖2 劃痕區(qū)L929遷移觀察

3.3 小鼠皮膚缺損修復(fù)實(shí)驗結(jié)果

小鼠膚缺損的修復(fù)情況如圖3所示，實(shí)驗組將SF/bFGF納米纖維膜和SF膜貼于小鼠的缺損部位，Con組不做任何處理。從第0 d到第18 d各組小鼠都陸續(xù)在修復(fù)，但修復(fù)速度不同，0 d時，纖維膜都牢牢的貼于缺損部位無需外力作用且有效的阻擋了血液的滲出；從第6 d到第18 d明顯看出SF/bFGF組小鼠缺損面積減小的快，到第18 d幾乎修復(fù)完成，SF組和Con組未修復(fù)完成。

圖3 小鼠皮膚缺損修復(fù)的大體觀察

3 討論

SF與bFGF混紡獲得SF/bFGF納米纖維膜，結(jié)果顯示纖維間有黏連推測復(fù)合膜片結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，力學(xué)性能較好，SF/bFGF納米纖維膜是一種相對較好的載體材料。L929的遷移實(shí)驗結(jié)果顯示，SF/bFGF組比對照組細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯多且距離遠(yuǎn)，說明將SF/bFGF包被于培養(yǎng)皿底能有效促進(jìn)細(xì)胞的遷移且表現(xiàn)出了bFGF的活性。小鼠皮膚缺損修復(fù)實(shí)驗大體結(jié)果顯示，SF/bFGF和SF均能促進(jìn)小鼠皮膚缺損修復(fù)，SF/bFGF尤為明顯，雖然Con組各小鼠到第6天的修復(fù)面積標(biāo)準(zhǔn)偏差較其他組大，不影響整體修復(fù)結(jié)果。整體結(jié)果說明通過靜電紡絲獲得的SF/bFGF納米纖維膜表現(xiàn)出了bFGF的天然活性，也說明以絲素蛋白作可作為bFGF的承載材料。