劉娜，李文謙

（淮陰工學(xué)院，江蘇淮安 223003）

磷是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素之一，在土壤中含量較高，但絕大多數(shù)不能被植物直接吸收利用。我國74%的耕地土壤缺磷，土壤中無效磷占了95%以上[1]。因此，必須向土壤中施入大量可溶性磷肥，以提高作物產(chǎn)量，但當(dāng)季磷肥利用率較低，為5%～10%[2]，大部分磷與Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+結(jié)合形成難溶性磷酸鹽，作物難以利用，使得磷元素在土壤中大量積累，降低磷利用率并帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染。

土壤中存在許多微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，具有這種能力的微生物叫做解磷菌或溶磷菌（Phosphate-solubilizing microorganisms）[3]。本文對枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到相對較高的解磷能力和生長量，為利用解磷菌提高土壤中磷利用率提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌，在實驗室沙土管保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、氯化鈉5g/L，調(diào)節(jié)pH為7.4～7.6。

解磷液體培養(yǎng)基：蔗糖10g/L、磷酸鈣10g/L、氯化鈉0.3g/L、氯化鉀0.3g/L、硫酸鎂0.3g/L、硫酸亞鐵0.03g/L、硫酸錳0.03g/L、硫酸銨0.5g/L、酵母提取物0.5g/L，pH7.2，115℃滅菌 20min。

碳源培養(yǎng)基：將解磷培養(yǎng)基中的碳源分別替換成蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖，其他成分保持不變。

氮源培養(yǎng)基：將解磷培養(yǎng)基中的氮源分別替換成硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉和尿素，其他成分保持不變。

重金屬離子培養(yǎng)基：在液體解磷培養(yǎng)基中分別加入 Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+金屬離子，其濃度保持一致。

1.1.3 儀器設(shè)備

主要有紫外分光光度計（UV-1800上海印溪儀器儀表有限公司）、分析天平（FA2004 上海菁海儀器有限公司）、電子天平（TD5002G 天津天馬衡基儀器有限公司）、超凈工作臺（BCM-1000 蘇州凈化設(shè)備有限公司）、滅菌鍋（YM100Z 100L 上海三申醫(yī)療器械有限公司）、恒溫培養(yǎng)搖床（HYL-B太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司）、pH計（E-201-C上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 吸光度值與菌體濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

收集發(fā)酵液后測定其吸光度值，利用比濁法（600nm）測定[4]，然后離心稱重，得到細(xì)菌的濕重。再烘干稱重得到其干重。以菌濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.5503x-0.1183，回歸系數(shù)R2=0.9898，含水量約為10%。

圖1 菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 枯草芽孢桿菌菌體生長量測定

取微量被保藏于沙土中的解磷菌到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，通過分光光度計測定吸光度，以1.2.1計算得出菌濃度。以時間為橫坐標(biāo)，菌濃度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，據(jù)此確定菌株在發(fā)酵培養(yǎng)中的最佳接種時間。

1.2.3 液體培養(yǎng)條件下溶磷能力測定

分別吸取5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)緩沖液0mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL于50 mL容量瓶中，加去離子水至30 mL，加鉬銻抗試劑5 mL，搖勻，定容得濃度為 0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L溶液，靜置約30min后，在700nm波長紫外分光光度計上進(jìn)行顯色比色，以磷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]，結(jié)果如圖2所示。鉬銻抗磷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.5031x+0.0034，通過磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中有效磷含量，以確定菌株的溶磷能力。

圖2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線（鉬銻抗顯色劑）

1.2.4 不同培養(yǎng)條件對解磷菌解磷能力的影響

1.2.4.1 最適溫度的測定

（1）挑取微量被保藏于沙土中的解磷菌到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28℃活化12h時，之后取5 mL已活化的細(xì)菌菌懸液加入裝有100 mL液體解磷培養(yǎng)基的錐形瓶中，重復(fù)10瓶，每兩瓶為一組，并調(diào)節(jié)pH為7.0，分別在22℃、25℃、28℃、31℃、34℃，180r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

（2）在600nm吸光度下讀出數(shù)值，即為解磷菌的菌體濃度。重復(fù)多次，讀出單因素的各組數(shù)值，整理數(shù)據(jù)并作圖。

（3）使用鉬銻抗分光光度法檢測上清液中可溶性磷的含量。吸取5mL原液于50mL容量瓶中，加入約25mL蒸餾水，滴入一滴酚酞顯色劑，逐滴加入濃度為0.1mol/LNaOH溶液，直至溶液變?yōu)榉奂t色。再加入5mL現(xiàn)配好的鉬銻抗試劑，然后迅速定容到50mL標(biāo)準(zhǔn)刻度線，搖勻室溫靜置30min。然后用分光光度計于700nm處測出各樣品吸光度，記錄數(shù)據(jù)。在其他基礎(chǔ)培養(yǎng)條件不變的情況下，分別以pH、碳源、氮源、金屬離子、搖床轉(zhuǎn)速為單因素設(shè)置不同的實驗梯度。

1.2.4.2 最適pH條件的測定

調(diào)節(jié)pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在28℃，180r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

1.2.4.3 最適碳源條件的測定

分別將碳源替換成蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖和葡萄糖，并調(diào)節(jié)pH為7.0，在28℃，180r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

1.2.4.4 最適氮源條件的測定

分別將氮源替換成硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉和尿素，并調(diào)節(jié)pH為7.0，在28℃，180r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

1.2.4.5 最適金屬離子條件的測定

在液體解磷培養(yǎng)基中分別加入Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+幾種金屬離子，其濃度保持一致。

1.2.4.6 最適搖床速率條件的測定

在28℃，轉(zhuǎn)速分別為140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

1.2.5 正交試驗確定解磷細(xì)菌的最適生長條件

根據(jù)單因素試驗的試驗結(jié)果縮小到一定范圍，然后選擇3個水平變量進(jìn)行試驗[6]，pH選擇6.0、6.5、7.0三個梯度，碳源選擇葡萄糖、果糖和蔗糖三種，氮源則選擇硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀3種[7]。采用L9（33）正交設(shè)計試驗對溶磷菌溶磷過程中最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。種子液按5%接種量接種于培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。利用比濁法（600nm）測定解磷菌的菌體濃度，鉬銻抗比色法測定菌液中可溶性磷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線

如圖3所示，2～12h為對數(shù)生長期，其菌濃度在12h處達(dá)到最大值，隨后穩(wěn)定在一定濃度。所以，實驗選取活化12h后的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因素以及正交試驗[8]。

圖3 枯草芽孢桿菌生長曲線

2.2 最適培養(yǎng)條件選擇

2.2.1 溫度對解磷菌生長量和解磷量的影響

根據(jù)圖4所示，溫度為22～28℃時菌濃度呈現(xiàn)上升趨勢，在大約28℃時菌體的菌濃度達(dá)到最大值，表明在28℃時菌體生長量最多。同時溶液中的磷濃度在22～31℃呈上升趨勢，所以28℃為該解磷菌種最適培養(yǎng)溫度。

圖4 溫度對解磷菌生長量和解磷量的影響

2.2.2 pH對解磷菌生長量和解磷量的影響

根據(jù)圖5所示，pH為5.5～6.5時，菌濃度以及磷濃度都呈現(xiàn)上升趨勢，并且在pH6.5～7.5呈現(xiàn)菌濃度和磷濃度處于下降狀態(tài)，由此可以得出，在pH6.5左右時為該解磷菌種的最適pH培養(yǎng)條件。

圖5 pH對解磷菌生長量和解磷量的影響

2.2.3 碳源對解磷菌生長量和解磷量的影響

碳源是解磷微生物生長發(fā)育必需的因素之一[9]，糖類是最主要的碳源。糖類又可以分為單糖、二糖、多糖三種。根據(jù)圖6數(shù)據(jù)所反映出的結(jié)果，葡萄糖和果糖兩種單糖對解磷菌生長幫助最大，同時解磷效果也是最佳的，二糖對生長量的促進(jìn)效果和對菌體的解磷效果不如單糖。所以，培養(yǎng)該菌種時應(yīng)當(dāng)選用單糖，其中葡萄糖效果最好。

圖6 不同碳源對解磷菌生長量和解磷量的影響

2.2.4 氮源對解磷菌生長量和解磷量的影響

氮源也是解磷菌種必不可少的一種營養(yǎng)要素，圖7的柱狀圖可以反映出幾種氮源對解磷菌種的生長量以及其解磷效果的不同影響。其中，硫酸銨對生長量促進(jìn)最大，其次是硝酸銨和硝酸鉀，硝酸鈉以及尿素的促進(jìn)作用較差。

同樣觀察磷濃度，也能夠直觀地發(fā)現(xiàn)，硫酸銨對解磷微生物的解磷效力有著十分明顯的促進(jìn)作用，硝酸銨的促進(jìn)作用第二，接下來分別是硝酸鉀和硝酸鈉，尿素的促進(jìn)作用最差。由此可以確定，硫酸銨是最佳的氮源選擇，不僅可以達(dá)到最多的菌體生長量，而且能使菌體大量溶解無機磷，從而達(dá)到最高溶磷量。

圖7 不同氮源對解磷菌生長量和解磷量的影響

2.2.5 金屬離子對解磷菌生長量和解磷量的影響

金屬離子有著維持微生物生理功能的重要作用。它不僅構(gòu)成了許多細(xì)胞的內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)，并且能夠調(diào)節(jié)生理物質(zhì)對滲透壓的穩(wěn)定、pH的維持、以及對酶活力的調(diào)控。

從圖8可以看出，Mg2+、Mn2+可以顯著提高菌體生長量，而Fe2+對菌體生長量有著十分顯著的抑制作用，Zn2+、Cu2+對其生長量并無太大影響。再通過對磷濃度的比較，發(fā)現(xiàn)Mg2+、Mn2+對解磷量也同樣有著非常可觀的促進(jìn)作用，同樣，Zn2+、Cu2+對解磷量沒有明顯影響，而Fe2+卻有著抑制作用。因此在選擇金屬離子時，要注意添加合適濃度的Mg2+、Mn2+，避免高濃度的Fe2+對解磷菌產(chǎn)生抑制作用[10]。

圖8 不同金屬離子對解磷菌生長量和解磷量的影響

2.2.6 搖床速率對解磷菌生長量和解磷量的影響

根據(jù)圖9可以看出，在140～180r/min菌體濃度明顯呈現(xiàn)上升趨勢，而在180～220r/min菌體濃度則呈現(xiàn)下降趨勢，即當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到180r/min時菌體生長量達(dá)到峰值。再觀察磷濃度曲線我們也可以發(fā)現(xiàn)相同的趨勢，即當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到180r/min時，解磷微生物的溶磷量達(dá)到最大值。所以在選擇轉(zhuǎn)速時，應(yīng)當(dāng)選擇180r/min進(jìn)行培養(yǎng)。

圖9 搖床速率對解磷菌生長量和解磷量的影響

2.3 正交設(shè)計試驗結(jié)果分析

設(shè)計正交試驗，因素A為pH（水平1為6.0，水平2為6.5，水平3為7.0）；因素B為碳源（水平1為蔗糖，水平2為果糖，水平3為葡萄糖）；因素C為氮源（水平1為硫酸銨，水平2為硝酸銨，水平3為硝酸鉀）。結(jié)果見表1。

表1 不同因素對于解磷菌菌體生長量和解磷量的影響

由正交實驗結(jié)果可知，多種因素對于解磷菌生長量的影響力大小分別為：碳源＞氮源＞pH值。通過表1可知，最佳培養(yǎng)條件是A2B3C1，即pH6.5條件下以葡萄糖為碳源并以硫酸銨為氮源，此時菌體生長量最佳為0.505g/L，磷濃度為0.780mg/L。

3 結(jié)論

（1）該解磷菌的生長周期約為24h，在12h時菌活力最好，所以應(yīng)當(dāng)選取活化12h后的菌液接入發(fā)酵培養(yǎng)基效果最好。

（2）培育該種解磷菌種所采用的最佳培養(yǎng)條件是：在28℃的條件下，pH6.5，碳源選擇葡萄糖，以硫酸銨作為氮源，搖床速率選擇180r/min，適量添加Mg2+、Mn2+離子，避免高濃度Fe2+離子，此時的解磷菌菌體生長量達(dá)到最大值。并且在相同條件下，解磷菌的解磷量也達(dá)到最大值，所以最適條件與上述各條件相同。

（3）由正交實驗數(shù)據(jù)分析可知，多種因素對于解磷菌的菌體生長量和解磷量的影響力大小分別為碳源＞氮源＞pH值，即最佳培養(yǎng)條件是pH6.5條件下以葡萄糖為碳源并以硫酸銨為氮源，此時菌體的解磷效果最好，菌體生長量最佳為0.505g/L，磷濃度為0.780mg/L。