劉娜，李文謙

（淮陰工學(xué)院，江蘇淮安 223003）

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，在土壤中含量較高，但絕大多數(shù)不能被植物直接吸收利用。我國(guó)74%的耕地土壤缺磷，土壤中無(wú)效磷占了95%以上[1]。因此，必須向土壤中施入大量可溶性磷肥，以提高作物產(chǎn)量，但當(dāng)季磷肥利用率較低，為5%～10%[2]，大部分磷與Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+結(jié)合形成難溶性磷酸鹽，作物難以利用，使得磷元素在土壤中大量積累，降低磷利用率并帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染。

土壤中存在許多微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，具有這種能力的微生物叫做解磷菌或溶磷菌（Phosphate-solubilizing microorganisms）[3]。本文對(duì)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到相對(duì)較高的解磷能力和生長(zhǎng)量，為利用解磷菌提高土壤中磷利用率提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌，在實(shí)驗(yàn)室沙土管保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、氯化鈉5g/L，調(diào)節(jié)pH為7.4～7.6。

解磷液體培養(yǎng)基：蔗糖10g/L、磷酸鈣10g/L、氯化鈉0.3g/L、氯化鉀0.3g/L、硫酸鎂0.3g/L、硫酸亞鐵0.03g/L、硫酸錳0.03g/L、硫酸銨0.5g/L、酵母提取物0.5g/L，pH7.2，115℃滅菌 20min。

碳源培養(yǎng)基：將解磷培養(yǎng)基中的碳源分別替換成蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖，其他成分保持不變。

氮源培養(yǎng)基：將解磷培養(yǎng)基中的氮源分別替換成硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉和尿素，其他成分保持不變。

重金屬離子培養(yǎng)基：在液體解磷培養(yǎng)基中分別加入 Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+金屬離子，其濃度保持一致。

1.1.3 儀器設(shè)備

主要有紫外分光光度計(jì)（UV-1800上海印溪儀器儀表有限公司）、分析天平（FA2004 上海菁海儀器有限公司）、電子天平（TD5002G 天津天馬衡基儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（BCM-1000 蘇州凈化設(shè)備有限公司）、滅菌鍋（YM100Z 100L 上海三申醫(yī)療器械有限公司）、恒溫培養(yǎng)搖床（HYL-B太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、pH計(jì)（E-201-C上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 吸光度值與菌體濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

收集發(fā)酵液后測(cè)定其吸光度值，利用比濁法（600nm）測(cè)定[4]，然后離心稱重，得到細(xì)菌的濕重。再烘干稱重得到其干重。以菌濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.5503x-0.1183，回歸系數(shù)R2=0.9898，含水量約為10%。

圖1 菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)量測(cè)定

取微量被保藏于沙土中的解磷菌到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，以1.2.1計(jì)算得出菌濃度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌濃度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，據(jù)此確定菌株在發(fā)酵培養(yǎng)中的最佳接種時(shí)間。

1.2.3 液體培養(yǎng)條件下溶磷能力測(cè)定

分別吸取5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)緩沖液0mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL于50 mL容量瓶中，加去離子水至30 mL，加鉬銻抗試劑5 mL，搖勻，定容得濃度為 0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L溶液，靜置約30min后，在700nm波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行顯色比色，以磷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]，結(jié)果如圖2所示。鉬銻抗磷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.5031x+0.0034，通過(guò)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中有效磷含量，以確定菌株的溶磷能力。

圖2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線（鉬銻抗顯色劑）

1.2.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)解磷菌解磷能力的影響

1.2.4.1 最適溫度的測(cè)定

（1）挑取微量被保藏于沙土中的解磷菌到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28℃活化12h時(shí)，之后取5 mL已活化的細(xì)菌菌懸液加入裝有100 mL液體解磷培養(yǎng)基的錐形瓶中，重復(fù)10瓶，每?jī)善繛橐唤M，并調(diào)節(jié)pH為7.0，分別在22℃、25℃、28℃、31℃、34℃，180r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

（2）在600nm吸光度下讀出數(shù)值，即為解磷菌的菌體濃度。重復(fù)多次，讀出單因素的各組數(shù)值，整理數(shù)據(jù)并作圖。

（3）使用鉬銻抗分光光度法檢測(cè)上清液中可溶性磷的含量。吸取5mL原液于50mL容量瓶中，加入約25mL蒸餾水，滴入一滴酚酞顯色劑，逐滴加入濃度為0.1mol/LNaOH溶液，直至溶液變?yōu)榉奂t色。再加入5mL現(xiàn)配好的鉬銻抗試劑，然后迅速定容到50mL標(biāo)準(zhǔn)刻度線，搖勻室溫靜置30min。然后用分光光度計(jì)于700nm處測(cè)出各樣品吸光度，記錄數(shù)據(jù)。在其他基礎(chǔ)培養(yǎng)條件不變的情況下，分別以pH、碳源、氮源、金屬離子、搖床轉(zhuǎn)速為單因素設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)梯度。

1.2.4.2 最適pH條件的測(cè)定

調(diào)節(jié)pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在28℃，180r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

1.2.4.3 最適碳源條件的測(cè)定

分別將碳源替換成蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖和葡萄糖，并調(diào)節(jié)pH為7.0，在28℃，180r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

1.2.4.4 最適氮源條件的測(cè)定

分別將氮源替換成硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉和尿素，并調(diào)節(jié)pH為7.0，在28℃，180r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

1.2.4.5 最適金屬離子條件的測(cè)定

在液體解磷培養(yǎng)基中分別加入Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+幾種金屬離子，其濃度保持一致。

1.2.4.6 最適搖床速率條件的測(cè)定

在28℃，轉(zhuǎn)速分別為140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h。

1.2.5 正交試驗(yàn)確定解磷細(xì)菌的最適生長(zhǎng)條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果縮小到一定范圍，然后選擇3個(gè)水平變量進(jìn)行試驗(yàn)[6]，pH選擇6.0、6.5、7.0三個(gè)梯度，碳源選擇葡萄糖、果糖和蔗糖三種，氮源則選擇硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀3種[7]。采用L9（33）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)溶磷菌溶磷過(guò)程中最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。種子液按5%接種量接種于培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。利用比濁法（600nm）測(cè)定解磷菌的菌體濃度，鉬銻抗比色法測(cè)定菌液中可溶性磷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

如圖3所示，2～12h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其菌濃度在12h處達(dá)到最大值，隨后穩(wěn)定在一定濃度。所以，實(shí)驗(yàn)選取活化12h后的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因素以及正交試驗(yàn)[8]。

圖3 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

2.2 最適培養(yǎng)條件選擇

2.2.1 溫度對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

根據(jù)圖4所示，溫度為22～28℃時(shí)菌濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在大約28℃時(shí)菌體的菌濃度達(dá)到最大值，表明在28℃時(shí)菌體生長(zhǎng)量最多。同時(shí)溶液中的磷濃度在22～31℃呈上升趨勢(shì)，所以28℃為該解磷菌種最適培養(yǎng)溫度。

圖4 溫度對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

2.2.2 pH對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

根據(jù)圖5所示，pH為5.5～6.5時(shí)，菌濃度以及磷濃度都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且在pH6.5～7.5呈現(xiàn)菌濃度和磷濃度處于下降狀態(tài)，由此可以得出，在pH6.5左右時(shí)為該解磷菌種的最適pH培養(yǎng)條件。

圖5 pH對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

2.2.3 碳源對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

碳源是解磷微生物生長(zhǎng)發(fā)育必需的因素之一[9]，糖類是最主要的碳源。糖類又可以分為單糖、二糖、多糖三種。根據(jù)圖6數(shù)據(jù)所反映出的結(jié)果，葡萄糖和果糖兩種單糖對(duì)解磷菌生長(zhǎng)幫助最大，同時(shí)解磷效果也是最佳的，二糖對(duì)生長(zhǎng)量的促進(jìn)效果和對(duì)菌體的解磷效果不如單糖。所以，培養(yǎng)該菌種時(shí)應(yīng)當(dāng)選用單糖，其中葡萄糖效果最好。

圖6 不同碳源對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

2.2.4 氮源對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

氮源也是解磷菌種必不可少的一種營(yíng)養(yǎng)要素，圖7的柱狀圖可以反映出幾種氮源對(duì)解磷菌種的生長(zhǎng)量以及其解磷效果的不同影響。其中，硫酸銨對(duì)生長(zhǎng)量促進(jìn)最大，其次是硝酸銨和硝酸鉀，硝酸鈉以及尿素的促進(jìn)作用較差。

同樣觀察磷濃度，也能夠直觀地發(fā)現(xiàn)，硫酸銨對(duì)解磷微生物的解磷效力有著十分明顯的促進(jìn)作用，硝酸銨的促進(jìn)作用第二，接下來(lái)分別是硝酸鉀和硝酸鈉，尿素的促進(jìn)作用最差。由此可以確定，硫酸銨是最佳的氮源選擇，不僅可以達(dá)到最多的菌體生長(zhǎng)量，而且能使菌體大量溶解無(wú)機(jī)磷，從而達(dá)到最高溶磷量。

圖7 不同氮源對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

2.2.5 金屬離子對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

金屬離子有著維持微生物生理功能的重要作用。它不僅構(gòu)成了許多細(xì)胞的內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)，并且能夠調(diào)節(jié)生理物質(zhì)對(duì)滲透壓的穩(wěn)定、pH的維持、以及對(duì)酶活力的調(diào)控。

從圖8可以看出，Mg2+、Mn2+可以顯著提高菌體生長(zhǎng)量，而Fe2+對(duì)菌體生長(zhǎng)量有著十分顯著的抑制作用，Zn2+、Cu2+對(duì)其生長(zhǎng)量并無(wú)太大影響。再通過(guò)對(duì)磷濃度的比較，發(fā)現(xiàn)Mg2+、Mn2+對(duì)解磷量也同樣有著非?？捎^的促進(jìn)作用，同樣，Zn2+、Cu2+對(duì)解磷量沒(méi)有明顯影響，而Fe2+卻有著抑制作用。因此在選擇金屬離子時(shí)，要注意添加合適濃度的Mg2+、Mn2+，避免高濃度的Fe2+對(duì)解磷菌產(chǎn)生抑制作用[10]。

圖8 不同金屬離子對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

2.2.6 搖床速率對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

根據(jù)圖9可以看出，在140～180r/min菌體濃度明顯呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而在180～220r/min菌體濃度則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，即當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到180r/min時(shí)菌體生長(zhǎng)量達(dá)到峰值。再觀察磷濃度曲線我們也可以發(fā)現(xiàn)相同的趨勢(shì)，即當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到180r/min時(shí)，解磷微生物的溶磷量達(dá)到最大值。所以在選擇轉(zhuǎn)速時(shí)，應(yīng)當(dāng)選擇180r/min進(jìn)行培養(yǎng)。

圖9 搖床速率對(duì)解磷菌生長(zhǎng)量和解磷量的影響

2.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素A為pH（水平1為6.0，水平2為6.5，水平3為7.0）；因素B為碳源（水平1為蔗糖，水平2為果糖，水平3為葡萄糖）；因素C為氮源（水平1為硫酸銨，水平2為硝酸銨，水平3為硝酸鉀）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同因素對(duì)于解磷菌菌體生長(zhǎng)量和解磷量的影響

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，多種因素對(duì)于解磷菌生長(zhǎng)量的影響力大小分別為：碳源＞氮源＞pH值。通過(guò)表1可知，最佳培養(yǎng)條件是A2B3C1，即pH6.5條件下以葡萄糖為碳源并以硫酸銨為氮源，此時(shí)菌體生長(zhǎng)量最佳為0.505g/L，磷濃度為0.780mg/L。

3 結(jié)論

（1）該解磷菌的生長(zhǎng)周期約為24h，在12h時(shí)菌活力最好，所以應(yīng)當(dāng)選取活化12h后的菌液接入發(fā)酵培養(yǎng)基效果最好。

（2）培育該種解磷菌種所采用的最佳培養(yǎng)條件是：在28℃的條件下，pH6.5，碳源選擇葡萄糖，以硫酸銨作為氮源，搖床速率選擇180r/min，適量添加Mg2+、Mn2+離子，避免高濃度Fe2+離子，此時(shí)的解磷菌菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最大值。并且在相同條件下，解磷菌的解磷量也達(dá)到最大值，所以最適條件與上述各條件相同。

（3）由正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，多種因素對(duì)于解磷菌的菌體生長(zhǎng)量和解磷量的影響力大小分別為碳源＞氮源＞pH值，即最佳培養(yǎng)條件是pH6.5條件下以葡萄糖為碳源并以硫酸銨為氮源，此時(shí)菌體的解磷效果最好，菌體生長(zhǎng)量最佳為0.505g/L，磷濃度為0.780mg/L。