劉佳,郭少林,陳婷婷,張繼業(yè),范清玉
(西安培華學(xué)院,陜西西安 710125)
商洛地理位置優(yōu)越,處于秦嶺南麓,因此有著豐富的天然藥材,也被譽(yù)為天然藥庫。其中桔梗作為多年生的草本植物,是當(dāng)?shù)刂饕乃幉念愋?,藥效價(jià)值較高,并且有一定的營養(yǎng)價(jià)值,在心腦血管預(yù)防及宣肺止咳方面療效明顯,市場銷售理想。此外商洛地區(qū)的桔??梢允朝?,通過研究其化學(xué)成分,我們認(rèn)為其根莖中蘊(yùn)含著豐富的多糖苷,也就是百姓俗稱的桔梗皂苷。此外還含有豐富的多糖,維生素,氨基酸等物質(zhì)。當(dāng)前對于其多糖成分的研究還不夠深入,更多的是其藥理活性價(jià)值的分析,臨床上認(rèn)為其可以抗疲勞,降血糖,而接下來對其多糖的工藝制備研究還不夠系統(tǒng)與完善,這也是我們后期借助超聲輔助技術(shù)提取多糖的主導(dǎo)思路。事實(shí)驗(yàn)證其成效十分明顯,既能大幅縮短提取時(shí)間,也能確保多糖的得率。而本文主要以液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度作為試驗(yàn)因素,基于響應(yīng)面法探討超聲輔助技術(shù)支持下的桔梗多糖提取工藝,以期獲得桔梗多糖得率最大限度的提升,推動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展。
桔梗藥材,采自陜西省商洛市,為3年生桔梗的干燥根莖。
755B紫外光光度計(jì)、BILON-1000CT超聲波提取器、工業(yè)用電子天平、冷凍干燥機(jī)、TGL-20bR的高速冷凍離心機(jī)、RE-3000B的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
1.2.1 桔梗多糖的制備及含量測定。
獲取桔梗根莖,進(jìn)行初步的粉碎處理,進(jìn)行石油醚脫脂,進(jìn)行超聲輔助熱水回流提取,進(jìn)行離心處理,獲得上清液,液體濃縮,進(jìn)行乙醇沉淀,進(jìn)行離心沉淀,采用Sevage法除蛋白透析后進(jìn)行真空冷凍干燥處理,最終獲得桔梗多糖。采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量的測量,具體的測量公式為M粗多糖/M桔梗粉末×100%
1.2.2 試驗(yàn)單因素分析
在桔梗多糖制備過程中進(jìn)行單因素的試驗(yàn)分析。分別選擇液料比為20∶1、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度80℃、超聲功率150 W,這些都是試驗(yàn)對照指標(biāo),而對應(yīng)的單因素試驗(yàn)指標(biāo)為:液料比(10∶1,20∶1,30∶1,60∶1)、超聲時(shí)間(20、40、60min)、超聲溫度(40、60、80℃)、超聲功率(75、100、125、150W),探討單因素對桔梗多糖得率的影響。單因素試驗(yàn)分析時(shí),其他因素選擇的是固定水平,起到實(shí)驗(yàn)對照的積極作用。其中桔梗多糖得率為主要的試驗(yàn)指標(biāo),據(jù)此繪制單因素曲線圖,進(jìn)行單一因素對其得率的具體影響的試驗(yàn)分析。
1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化桔梗多糖提取
綜合考慮到單因素的試驗(yàn)結(jié)果,對液料比,超聲時(shí)間,超聲溫度及超聲功率等進(jìn)行自變量的分析,參考Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì),以桔梗多糖得率作為響應(yīng)值,分別開展四大因素的響應(yīng)面試驗(yàn),借助通用的Design Expert8.06軟件進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的分析。
此次試驗(yàn)無論是方案的設(shè)計(jì)與部署還是模型的建構(gòu)都使用的Design Expert8.06軟件,采用Excel 2016進(jìn)行收集到數(shù)據(jù)的處理,采用SPSS18.0軟件中的單因素ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)因素的統(tǒng)計(jì)分析。
基于苯酚-硫酸法測定總糖含量,繪制曲線,如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系中對應(yīng)的R2數(shù)值為0.9965,對應(yīng)的總糖含量為87.51%。
圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖2可知,超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率、液料比四個(gè)因素對桔梗多糖得糖率有明顯影響,液料比對桔梗得糖率的影響是呈線性增長的,達(dá)到一定程度后趨于平緩。常規(guī)情況下,在液料比25∶1時(shí)會(huì)達(dá)到峰值,之后開始緩慢下降。而超聲時(shí)間對其得糖率的影響屬于正態(tài)分布模式,呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。常規(guī)情況下20分鐘時(shí)達(dá)到頂峰。超聲溫度與桔梗得糖率也是正相關(guān)的關(guān)系,隨著超聲溫度的提升,桔梗的得糖率明顯提升,一般認(rèn)為70℃為得糖率最高的溫度。在這之后逐步下降。最后超聲功率對桔梗得糖率也有一定影響,其與超聲溫度的影響一致,是正相關(guān)關(guān)系,呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。
圖2 試驗(yàn)因素對桔梗多糖得率的影響
2.3.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果
在單因素分析的基礎(chǔ)之上進(jìn)行綜合因素的影響分析,主要是開展液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率與PGPs得率之間的水平響應(yīng)面試驗(yàn)?;鵅ox-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,輔助Design Expert 8.06試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件和 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對綜合因素影響結(jié)果進(jìn)行分析,得到桔梗多糖得率(Y)對液料比(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲溫度(C)和超聲功率(D)的四元二次回歸方程:
Y=7.907+0.587A+0.165B+0.072C-0.084D-0.141AB-0.202AC-0.054AD+0.084BC+0.053BD+0.214CD-0.380A2-0.082B2-0.261C2-0.219D2
從方程結(jié)果看,液料比的影響性大于超聲時(shí)間,而超聲時(shí)間大于超聲功率,而超聲功率大于超聲溫度;基于二次項(xiàng)看,液料比、超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間依次減弱。
2.3.2 響應(yīng)面分析
數(shù)據(jù)擬合后得出回歸方程,進(jìn)行各因素響應(yīng)曲線的繪制。其中交互作用顯著與否受實(shí)驗(yàn)因素影響明顯,如果響應(yīng)曲面中曲線走勢明顯則意味著該因素對桔梗得糖率影響增大。如果曲線平緩則影響小。最終結(jié)果顯示:液料比的影響最大,其次是超聲功率和溫度,最后是超聲時(shí)間。
進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)工藝優(yōu)化處理,對應(yīng)的研究結(jié)論是:液料比21.35∶1,超聲時(shí)間19.53min,超聲溫度70.3 ℃,超聲功率151.53 W,綜合這些條件,PGPs得率可達(dá)最大值8.172%。此條件下重復(fù)5次,PGPs平均得率為8.108%(純度為87.43%)接近模型預(yù)測值,可以在桔梗多糖工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)踐中得以運(yùn)用與推廣。
多次試驗(yàn)結(jié)果表明:采用超聲輔助熱水浸提桔梗多糖最佳因素組合為:液料比為20∶1,超聲時(shí)間20min,超聲溫度70℃,超聲功率150W,這些條件綜合作用下,桔梗多糖率最高。各因素對桔梗多糖的影響呈現(xiàn)先增后減的趨勢。深入分析原因,一般認(rèn)為桔梗為多年生的草本植物,其多糖成分屬于胞內(nèi)多糖,提取時(shí)需要對植物細(xì)胞壁進(jìn)行破除,利用超聲波的空化作用延長提取時(shí)間確保細(xì)胞壁破除率提升,確保多糖得糖率。這也不是絕對的,如果延長超聲時(shí)間無限制增加,則超聲波的空化作用對桔梗的多糖結(jié)構(gòu)起到一定的破壞性,如果持續(xù)性的高溫也導(dǎo)致多糖得糖率達(dá)到頂峰后的急速下降,這些都有學(xué)者在試驗(yàn)中進(jìn)行了驗(yàn)證與論述。