夏勝濤，徐珍香，李洪啟＊

（1.東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620；2.蓬萊新光顏料化工有限公司，山東蓬萊 265601）

鋅是生物體內(nèi)第二豐富的過渡金屬[1]，在酶的調(diào)控、神經(jīng)信號(hào)傳遞、基因表達(dá)等[2-4]各種生理過程中都發(fā)揮著重要的作用，是人體必不可缺少的一種微量元素[5]。盡管大多數(shù)生物體中的鋅離子與蛋白質(zhì)緊密地結(jié)合，但在某些細(xì)胞中“游離鋅”仍然有存在的可能，生活中部分嚴(yán)重生理疾病與鋅離子的失衡密密相關(guān)，如阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）、帕金森病、腦缺血和癲癇等[6-10]。因此，對(duì)Zn2+離子特定檢測(cè)方法引發(fā)也來越多的人關(guān)注，到目前為止，鋅離子的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展。

傳統(tǒng)的Zn2+檢測(cè)方法只適用于生物體外的Zn2+檢測(cè)，對(duì)生物體內(nèi)的Zn2+很難有效果。新型檢測(cè)方法熒光分析法在這方面尤為突出，它不僅能突破傳統(tǒng)方法的局限，而且還具有高選擇性、高靈敏性和良好生物適用性等優(yōu)點(diǎn)，因此，設(shè)計(jì)和合成出新的Zn2+探針具有重要的意義[11]。此外，香豆素類衍生物本身不僅具有較長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)，熒光效果好而且具有Stokes位移大、高熒光量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性好等優(yōu)良的光學(xué)特性[12-14]，能很好作為一種熒光基團(tuán)，香豆素類衍生物在熒光探針方向的研究成為探針方向的主題，這方面的報(bào)道也越來越多。基于以上這兩點(diǎn)，本文設(shè)計(jì)了一種香豆素類席夫堿Zn2+的熒光探針，該探針對(duì)Zn2+具有較好的選擇性和靈敏性，且體系的熒光強(qiáng)度隨著Zn2+濃度增大而增強(qiáng)，在一定的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

本文以間苯二酚和苯甲酰乙酸乙酯為原料合成4-苯基-7-羥基香豆素（1），再在烏洛托品與醋酸條件下合成4-苯基7-羥基-8-甲?；愣顾兀?），最后與苯甲酰肼反應(yīng)合成4-苯基-7-羥基-8-(苯甲酰腙基)香豆素（L），化合物的合成路線如圖1所示。

圖1 化合物L(fēng)的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

PY-1型熔點(diǎn)儀（天津市國(guó)銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司）、Bruker AM400型核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）、Fluoromax-4熒光測(cè)試儀（HORIBA Scientific公司）、UV-1700紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）。

間苯二酚、硫酸、冰醋酸、烏洛托品，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯甲酰乙酸乙酯、苯甲酰肼，均為分析純，購(gòu)自上海泰坦化學(xué)有限公司；甲醇，分析純，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；對(duì)甲苯磺酸一水合物，分析純，購(gòu)自阿拉丁公司。

1.2 化合物L(fēng)的合成

1.2.1 4-苯基-7-羥基香豆素的合成

將70 mL甲醇逐滴加入到30 mL濃硫酸中，得到無色透明溶液。將間苯二酚（5.5 g，50 mmol）溶于上述100 mL溶劑中，升溫至60℃，在磁力攪拌下使其完全溶解，然后用恒壓滴液漏斗緩慢滴加苯甲酰乙酸乙酯（9.7 g，50 mmol），滴加完畢后繼續(xù)加熱攪拌4 h。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，加入冰水，有大量黃色固體析出，靜置后抽濾，將濾餅放入真空干燥箱中干燥，用乙醇重結(jié)晶后得到淡黃色固體9.76 g，產(chǎn)率為 82%，m. p. 249～ 251 ℃（文獻(xiàn)值[15]：250.2～250.5℃）。

1.2.2 4-苯基-7-羥基-8-甲?；愣顾氐暮铣?/p>

將4-苯基-7-羥基香豆素（1.19 g，5 mmol）和烏洛托品（7.0 g，50 mmol）溶于20 mL冰乙酸，水浴加熱升溫至90℃，攪拌反應(yīng)6～8 h后，加入24 mL的17% HCl水溶液繼續(xù)反應(yīng)10 min，待反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入到40 mL蒸餾水中，有大量黃棕色固體析出。靜置后抽濾，干燥，用乙醇重結(jié)晶后得到黃綠色固體0.8 g，產(chǎn)率為60%。m. p.120～122℃（文獻(xiàn)值[16]：120℃）。

1.2.3 4-苯基-7-羥基-8-苯腙基香豆素（L）的合成

將4-苯基-7-羥基-8-甲?；愣顾兀?.33 g，5 mmol）、苯甲酰肼（0.68 g， 5 mmol）和對(duì)甲苯磺酸（5 mg， 0.025 mmol）溶于30 mL乙醇中，80℃下磁力攪拌回流4 h，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，底部有淺黃色固體析出，抽濾，干燥，得到化合物L(fēng)粗品。采用硅膠柱層析對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純，洗脫劑PE∶EA=10∶1，得到1.35 g淺黃色固體，產(chǎn)率為70%，m. p. 262～264℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz),δ:12.91 (s, 1H); 12.50 (s, 1H);9.21 (s, 1H); 8.00 (d, J=7.3 Hz, 2H); 7.64～7.67 (m,1H); 7.58～7.60 (m, 5H); 7.53～7.54 (m, 2H); 7.37(d, J=8.9 Hz, 1H); 6.95 (d, J=9.0 Hz, 1H); 6.28 (s, 1H)。13C NMR (DMSO, 100 MHz), δ:162.51, 161.24, 159.06,155.48, 153.17, 143.47, 134.84, 132.31, 132.01, 129.70,129.30, 128.85, 128.63, 128.43, 127.63, 113.76, 110.90,110.52, 106.02; HRMS, C23H17N2O4, 實(shí)測(cè)值（計(jì)算值）,m/z:385.1180(385.1183)[M+H]+。

2 結(jié)果與分析

2.1 探針L的離子選擇性實(shí)驗(yàn)

在CH3CN∶H2O=9∶1（v∶v）溶液中，探針分子L和金屬離子的濃度為40 μmol/L，識(shí)別對(duì)象為13種常見的金屬離子（Cu2+、Cr3+、Hg2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、K+、Li+、Al3+、Fe2+、Sr2+、Ag+、Fe3+）。如圖2所示，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)λex=380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為λem=495 nm時(shí)，Zn2+可使探針L的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)8倍左右，Hg2+可使探針L的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)4倍，而其他金屬離子對(duì)探針L的熒光強(qiáng)度沒有產(chǎn)生顯著的影響。

圖2 探針L對(duì)金屬離子的選擇性

2.2 探針L的滴定實(shí)驗(yàn)

在CH3CN∶H2O=9∶1（v∶v）溶液中，探針分子L的濃度不變?yōu)?0 μmol/L，然后逐漸加大Zn2+濃 度（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0μmol/L和 40.0 μmol/L），如圖3所示，探針L隨著Zn2+濃度增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，達(dá)到40 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，增強(qiáng)約10倍，如圖4所示探針L在加入0～40 μmol/L Zn2+后具有良好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9779。

圖3 探針L隨Zn2+濃度增加的熒光強(qiáng)度變化

2.3 探針L的離子抗干擾性實(shí)驗(yàn)

在CH3CN∶H2O=9∶1（v∶v）溶液中，探針分子L和Zn2+的濃度為40 μmol/L，再加入其他金屬離子40 μmol/L，如圖5所示，標(biāo)注為I的表示每種金屬離子分別對(duì)探針L熒光強(qiáng)度的影響，標(biāo)注為II的表示加入等濃度的Zn2+后各金屬離子對(duì)探針L熒光強(qiáng)度的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液中Zn2+與其他金屬離子共存時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度均會(huì)增強(qiáng)，尤其是Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Fe3+這幾種金屬離子與 Zn2+共存時(shí)，對(duì)體系熒光強(qiáng)度影響較大，導(dǎo)致不能很好地檢測(cè)Zn2+，所以該探針的抗離子干擾性較差，離子共存后靈敏性受到了一定的影響。

圖4 探針L熒光強(qiáng)度與Zn2+濃度線性圖

圖5 不同金屬離子對(duì)探針L檢測(cè)Zn2+的干擾性

2.4 pH對(duì)探針L穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在CH3CN∶H2O=1∶9（v∶v）溶液中，探針分子L和Zn2+的濃度為10 μmol/L時(shí)，測(cè)定了pH對(duì)探針L識(shí)別Zn2+的影響。圖6為酸性條件下，不同pH值對(duì)溶液熒光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)探針L最大發(fā)射波長(zhǎng)從495 nm紅移到515 nm，隨著pH值的升高，溶液熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)pH=7時(shí)，達(dá)到最大值；pH=1或2時(shí)，探針L熒光強(qiáng)度極低，探針L穩(wěn)定性差。圖7為堿性條件下，不同pH值對(duì)溶液熒光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)探針L最大發(fā)射波長(zhǎng)從495 nm紅移到515 nm；pH = 12、13或14時(shí)，探針L熒光強(qiáng)度極低，探針L穩(wěn)定性差。據(jù)此可知探針L耐酸和耐堿性能較差，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下穩(wěn)定性差。

圖6 酸性條件下L識(shí)別Zn2+熒光強(qiáng)度變化

2.5 探針L的Job曲線實(shí)驗(yàn)

利用Job配合曲線法進(jìn)一步測(cè)定了探針L與Zn2+的配合情況。探針L和Zn2+濃度都為20 μmol/L且保持探針L與Zn2+的總濃度為2×10-5mol/L，然后逐漸改變探針L與Zn2+的物質(zhì)的量比（0.1～0.9），分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度F對(duì)物質(zhì)的量比作圖得到Job曲線，如圖8所示，探針L與Zn2+形成1∶2的配合物。

圖7 堿性條件下L識(shí)別Zn2+熒光強(qiáng)度變化

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了新型香豆素類席夫堿型Zn2+熒光探針L，該探針對(duì)Zn2+的檢測(cè)表現(xiàn)出良好的選擇性和較高的靈敏度，且探針L具有一定的抗酸堿能力，在弱酸與弱堿條件下能有效檢測(cè)Zn2+，Job曲線測(cè)試結(jié)果表明探針L與Zn2+形成化學(xué)計(jì)量比為1∶2的絡(luò)合物。

圖8 探針L與Zn2+的Job曲線