秦康，朱智甲，孟爽，孟麗媛＊

（1.東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海201620；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)公共技術(shù)平臺，上海200025）

Fbxw7α，又被稱為FBW7、AGO、SEL10、CDC4，是SCF（Skp1-Cullin-F-box protein）蛋白泛素連接酶復(fù)合物的底物結(jié)合組分[1]，它可以靶向泛素化介導(dǎo)降解許多原癌基因，包括MCL-1、Notch、Myc、Jun、Cyclin E和mTOR。Fbxw7α的功能喪失性突變或缺失會誘導(dǎo)有利于腫瘤生長的癌基因的過表達(dá)，常見于各種類型的人類癌癥，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和T型急性淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）[2-3]。例如，在T-ALL中發(fā)現(xiàn)Fbxw7α發(fā)生R465H，R479L或R505C突變[3]，小鼠造血干細(xì)胞中Fbxw7α的缺失會導(dǎo)致T細(xì)胞惡性腫瘤[4]，這些都證明Fbxw7α是一種腫瘤抑制因子。

Fbxw7蛋白具有Fbxw7α、Fbxw7β和Fbxw7γ三種，它們亞型結(jié)構(gòu)相同、功能相似，但亞細(xì)胞定位不同。Fbxw7α定位于核漿，F(xiàn)bxw7β定位于細(xì)胞質(zhì)，而Fbxw7γ定位在核仁內(nèi)[5]，它們是從5'端10個外顯子中不同的外顯子翻譯而來[6]。Fbxw7蛋白包含F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域、WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域和D結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域是與SCF（Skp1-Cullin-F-box protein）復(fù)合體中的Skpl或Skpl類似蛋白結(jié)合的區(qū)域，WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域用來介導(dǎo)與底物蛋白的特異性識別，D結(jié)構(gòu)域是Fbxw7二聚化結(jié)合部位。

有報(bào)道證明，P53可以上調(diào)Fbxw7β的表達(dá)，并且與P53潛在的結(jié)合位點(diǎn)存在于人的Fbxw7的外顯子1b中[7]，表明Fbxw7是轉(zhuǎn)錄因子P53蛋白的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)。最近，有人報(bào)道了Fbxw7和P53對齲病發(fā)生的協(xié)同作用[8]。例如，P53突變體經(jīng)常在攜帶天然Fbxw7突變體的癌癥中發(fā)現(xiàn)[9]。在T淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤中，F(xiàn)bxw7基因的雜合性缺失經(jīng)常以Tp53依賴性方式發(fā)生[10]。Fbxw7突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞中的P53表現(xiàn)出高水平的絲氨酸-15磷酸化[9]。盡管有這些研究結(jié)果，F(xiàn)bxw7α和P53之間的相互作用尚未明確證實(shí)。在本研究中，進(jìn)行了免疫共沉淀聯(lián)合LC-MS/MS分析，并且比較了野生型（WT）Fbxw7α和F-box結(jié)構(gòu)域缺失的Fbxw7α突變體（ΔFbxw7α）之間的相互作用蛋白。發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了P53蛋白與Fbxw7α蛋白的相互作用，并揭示了Fbxw7α與P53在細(xì)胞周期調(diào)控中的直接聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞與菌種：293T細(xì)胞，DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞；試劑：K+、IPTG、各種酶及各種分析純試劑等；抗體：flag，cul1，skp1，F(xiàn)bxw7α，P53，HA，Actin，Mcl-1抗體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究主要采用的細(xì)胞系是人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞，培養(yǎng)在加入了10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞來源于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室細(xì)胞分化與凋亡國家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，在5% CO2的培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與點(diǎn)突變

使用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒（Stratagene，Palo Alto，CA）構(gòu)建具有定點(diǎn)突變體表達(dá)蛋白的質(zhì)粒。

1.2.3 免疫共沉淀分析（Co-IP）

收集表達(dá)帶有HA-P53或Flag-Fbxw7α標(biāo)簽蛋白的293T細(xì)胞，進(jìn)行超聲破碎，取上清，使用HA或Flag抗體及protein A/G對表達(dá)帶有HA或Flag標(biāo)簽蛋白的293T細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀。

1.2.4 激光共聚焦免疫熒光分析

在六孔板底部放入滅菌后的蓋玻片，加入適宜密度的293T細(xì)胞，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，進(jìn)行固定、打孔處理，隨后用不同抗性的P53及Fbxw7α抗體孵育，再用不同顏色對應(yīng)二抗孵育，最后加DAPI封片，進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 細(xì)胞周期分析

收集293T細(xì)胞，洗滌后用75%冷乙醇重懸并在-20 ℃下固定，再次洗滌后用100 μg/mL RNase A處理細(xì)胞，并用25 μg/mL碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色，通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布。

1.2.6 質(zhì)譜分析

來自免疫沉淀的蛋白質(zhì)樣品送至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)公共技術(shù)平臺蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行前處理及LC-MS/MS分析，使用Easy-nLC 1000h和LTQ orbitrap“XL”高分辨納升級液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行肽段序列分析，最后通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。數(shù)據(jù)庫搜索和數(shù)據(jù)分析的所有MS/MS離子光譜均由ProteoWizard msConvert提取，并使用Mascot（Matrix Science, London, UK；版本2.4.1）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定293T細(xì)胞中Fbxw7α相互作用蛋白

為了識別可能與Fbxw7α直接相互作用但不被SCF復(fù)合物的其他成分募集的蛋白質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染了標(biāo)志野生型（WT）Fbxw7α或Flag-F-box缺失的Fbxw7α突變體（ΔFbxw7α），其不能形成SCF與293T細(xì)胞中的Cullin1[11-12]復(fù)合，用抗Flag M2樹脂進(jìn)行親和沉淀，然后通過LC-MS/MS鑒定。如圖1所示，兩種蛋白均有很多與其相互作用的蛋白，F(xiàn)lag-WT Fbxw7α而不是F-box缺失的ΔFbxw7α突變體可以更有效地拉下SCF復(fù)合物的一些關(guān)鍵分子支架，如SKP1和Cullin1，這表明Flag-IP分析法可以有效分離Fbxw7α相互作用蛋白。從圖中發(fā)現(xiàn)，與Fbxw7α及ΔFbxw7α相互作用的蛋白質(zhì)中都有P53蛋白。

圖1 免疫共沉淀聯(lián)合LC-MS/MS尋找在293T細(xì)胞中與Flag-Fbxw7α和Flag-ΔFbxw7α相互作用蛋白的熱圖

2.2 Fbxw7α與P53的具有相互作用

通過免疫沉淀（IP）分析293T細(xì)胞內(nèi)源性P53和轉(zhuǎn)染過表達(dá)的Flag標(biāo)記的WT-Fbxw7α，F(xiàn)-box缺失的 Fbxw7α（ΔFbxw7α）或突變體 Fbxw7α（R465、R479和R505）之間的相互作用，如圖2所示，用Flag抗體進(jìn)行IP，蛋白免疫印跡顯示W(wǎng)T-Fbxw7α和ΔFbxw7α都有P53拉下來，而未轉(zhuǎn)入Flag-Fbxw7α及其3種突變體則沒有明顯的P53拉下來。同樣，HA抗體可以在與HA-P53和Flag-Fbxw7α共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中共沉淀Fbxw7α蛋白（圖3）且情況與Flag抗體進(jìn)行的共沉淀相同。這說明P53與Fbxw7α有相互作用且發(fā)生在Fbxw7α的WD40結(jié)構(gòu)域。此外，圖中還顯示了F-box結(jié)構(gòu)域缺失的Fbxw7α確實(shí)不能與Cullin1及SKP1發(fā)生相互作用，因此不形成SCF復(fù)合物，但卻顯示出與P53的強(qiáng)烈相互作用，而WD40 結(jié)構(gòu)域上的點(diǎn)突變則會影響它們之間互作用形成SCF復(fù)合體。

圖2 用Flag抗體檢測不同處理的Flag-Fbxw7α蛋白對內(nèi)源P53蛋白的免疫共沉淀情況

圖3 用HA抗體檢測HA-P53蛋白對不同處理的Flag-Fbxw7α蛋白的免疫共沉淀情況

通過對293T細(xì)胞中內(nèi)源性P53和Fbxw7α免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性P53和Fbxw7α具有共定位現(xiàn)象，如圖4所示，這也證明了Fbxw7α與P53具有相互作用。

2.3 Fbxw7α不會降解P53

為了評估P53是否是Fbxw7α通過SCF作用的底物，在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染一組不同劑量的Fbxw7α并用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，結(jié)果如圖5所示。在蛋白酶體抑制劑MG132存在下，P53蛋白質(zhì)增加，但外源性Fbxw7α的表達(dá)對其幾乎沒有影響。在不存在MG132的情況下，隨著Fbxw7α表達(dá)量的增加，P53蛋白量并沒有減少。而MCL-1是已知明確的SCF通過Fbxw7α降解的蛋白，如圖5所示，隨著Fbxw7α蛋白的增加，MCL-1明顯減少，而加入MG132后則有明顯增加的現(xiàn)象。這些數(shù)據(jù)表明P53不是Fbxw7α用于蛋白酶體降解的直接靶標(biāo)，盡管它作用于Fbxw7α的底物相互作用結(jié)構(gòu)域（圖2和圖3）。

圖4 293T細(xì)胞中蛋白P53和Fbxw7α的免疫熒光染色

圖5 不同表達(dá)量的Flag-Fbxw7α及蛋白酶體抑制劑MG132對P53蛋白表達(dá)量的影響

2.4 Fbxw7α過表達(dá)會使細(xì)胞阻滯在G1期

由于P53能夠影響許多細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，推測Fbxw7α可能通過與P53相互作用從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。使用雙胸苷阻斷，然后使用諾考達(dá)唑阻斷使細(xì)胞阻斷在G2/M期，并使用流式細(xì)胞術(shù)分析監(jiān)測細(xì)胞從G2/M期的進(jìn)展。結(jié)果如圖6所示，諾考達(dá)唑釋放后12 h，轉(zhuǎn)染EV和Fbxw7α-R479L的293T細(xì)胞中73.6%和85.2%的細(xì)胞進(jìn)入S期，而轉(zhuǎn)染Fbxw7α和ΔFbxw7α的293T細(xì)胞分別為61.3%和57.7%，表明Fbxw7α的表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯在G1期，但是這是否與P53相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文通過293T細(xì)胞中的免疫共沉淀聯(lián)合LC-MS/MS觀察到了P53和Fbxw7α之間的相互作用。為了確定是與Fbxw7α直接相互作用而不是通過SCF的其他成分相互作用的蛋白，在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型Fbxw7α以及F-box缺失的Fbxw7α突變體（ΔFbxw7α）并分選與這兩種形式的Fbxw7α相互作用的蛋白質(zhì)。隨后，通過免疫熒光和蛋白免疫共沉淀試驗(yàn)證明了P53和Fbxw7α之間的直接相互作用。而且，F(xiàn)bxw7α的表達(dá)沒有誘導(dǎo)P53蛋白的降解，表明P53不能通過與Fbxw7α相互作用從而通過SCF降解。考慮到P53的磷酸化及其降解與Fbxw7α高度相關(guān)，它們兩者之間的相互作用是否依賴于P53的磷酸化值得進(jìn)一步研究。另一方面，P53和Fbxw7α之間的相互作用對MDM2介導(dǎo)的P53降解的影響可能為解釋Fbxw7α對P53的作用提供一些線索。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)分析不同293T細(xì)胞的細(xì)胞周期

總之，本文證明了Fbxw7α和P53之間的直接相互作用，并且不介導(dǎo)P53的降解。另外，F(xiàn)bxw7α的過表達(dá)會使細(xì)胞周期阻滯在G1期，但是這是否與P53相關(guān)有待進(jìn)一步研究，這可能會揭示Fbxw7α調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的新機(jī)制。