林偉國(guó)，吳沖沖，宗明生，謝婧新，于鵬，榮峻峰

（中國(guó)石化 石油化工科學(xué)研究院，北京 100083）

由于化石能源的逐漸減少和環(huán)境污染的日益嚴(yán)峻，人們迫切需要尋找新的清潔能源來(lái)替代傳統(tǒng)能源。生物柴油具有環(huán)保性能好、發(fā)動(dòng)機(jī)啟動(dòng)性能好、燃料性能好、原料來(lái)源廣泛等特性，被視為主要的替代能源之一。目前，微藻是最具潛力的第三代生物能源原料，具有油脂含量高、生長(zhǎng)速度快、不與糧食競(jìng)爭(zhēng)、能產(chǎn)生多種高附加值產(chǎn)物、可消耗環(huán)境中的CO2等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。近年來(lái)，微藻生物柴油技術(shù)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4-5]，但由于成本及能耗高等原因，至今仍難達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)[6]。在微藻生物柴油的生產(chǎn)工藝中，油脂提取是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，因此研發(fā)具有高效節(jié)能的油脂提取技術(shù)是降低成本的有效途徑之一[7-8]。

微藻體積小且具有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞破碎一直是目前利用微藻培養(yǎng)和提取微藻油脂的難點(diǎn)之一[9]。目前，微藻破壁提油常用的方法有物理法、化學(xué)法、生物法[10-12]。物理法包括高速高壓均質(zhì)法、超聲法、反復(fù)凍融法等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，可以根據(jù)對(duì)最終產(chǎn)品需求的不同采用不同工藝提取微藻油脂?；瘜W(xué)法常用的有機(jī)溶劑提取法雖較為溫和，但所需時(shí)間長(zhǎng)，且對(duì)部分堅(jiān)硬藻油脂提取率較低[13]。生物法中水酶法是在水相中利用相關(guān)酶水解細(xì)胞壁，從而使油脂游離出來(lái)。該方法操作條件溫和，安全，污染少，生產(chǎn)過(guò)程能耗低，所得到的油脂質(zhì)量較高，生物相容性好，易于精煉，也可以用于處理濕藻，微藻采收后無(wú)需干燥，大大降低了能耗[14-16]。

本研究選用難以破壁提取油脂的微擬球藻和小球藻為研究對(duì)象，采用酸堿預(yù)處理與水酶法酶解微藻細(xì)胞相結(jié)合，高效提取微藻油脂，并考察了不同萃取溶劑對(duì)油脂提取率和提取油脂種類(lèi)的影響，為微藻生物質(zhì)的綜合利用提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品與試劑

微擬球藻，煙臺(tái)海融生物技術(shù)有限公司養(yǎng)殖；小球藻，石油化工科學(xué)研究院微藻實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖；冰醋酸、乙醇、NaOH、三氯甲烷、正己烷，分析純，購(gòu)自北京化工廠；2 000 IU /g纖維素酶、20 000 IU/g果膠酶、50 000 IU/g酸性蛋白酶，購(gòu)自北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微藻油脂的提取

（1）水熱法（酸熱法）。稱(chēng)取3 g微藻干粉于燒杯中，加入30 mL水，攪拌均勻，加入濃鹽酸控制反應(yīng)體系中鹽酸濃度為1 mol/L，在80 ℃下水浴加熱2 h，降至常溫，加入30 mL三氯甲烷萃取其中的微藻油脂，干燥脫除有機(jī)溶劑后得到微藻油脂。

（2）超聲法。稱(chēng)取3 g微藻干粉于燒杯中，加入50 mL水，攪拌均勻，在冰浴條件下超聲破碎，超聲功率為800 W，超聲時(shí)間為3 s，間歇5 s，處理15～30 min，再加入30 mL三氯甲烷萃取其中的微藻油脂，干燥脫除有機(jī)溶劑后得到微藻油脂。

（3）索氏抽提法。取稱(chēng)取3 g微藻干粉，研磨后轉(zhuǎn)移至濾紙筒放入抽提器內(nèi)安裝妥當(dāng)，注入抽提溶劑三氯甲烷至虹吸管高度以上，待抽提液流凈后，再加入混合液至虹吸管高度的2/3處。用脫脂棉塞入冷凝管上口，打開(kāi)冷凝管進(jìn)水管，加熱抽提。每小時(shí)回流7次。抽提8 h以上，至抽提管內(nèi)的混合液無(wú)油跡為止?；厥栈旌弦?，取下冷凝管和抽提筒，加熱除盡抽提瓶中殘余的混合液，將抽提瓶在105 ℃溫度下干燥至恒重，抽提瓶增加的量即為微藻總脂的量。

（4）水酶法。稱(chēng)取3 g微藻干粉于燒杯中，加入10 mL水，攪拌均勻，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到9，把藻液放入氧彈中，設(shè)置旋轉(zhuǎn)烘箱溫度為80～100 ℃，反應(yīng)8 h。之后從旋轉(zhuǎn)烘箱中取出氧彈，把藻液移入燒杯中，用醋酸調(diào)節(jié)pH到5，按照每種酶200 IU/g（微藻）的量加入纖維素酶、果膠酶、酸性蛋白酶中的一種或者兩種、三種組合，把藻液重新放回氧彈，在旋轉(zhuǎn)烘箱內(nèi)于50 ℃下反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后用有機(jī)溶劑萃取微藻油脂，干燥脫除有機(jī)溶劑后得到微藻油脂。

1.2.2 微藻油脂中可皂化物和不可皂化物的測(cè)量

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的微藻油脂樣品約5 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g），記錄其質(zhì)量m1，放于斜三口圓底燒瓶中，加入1 mol/L的KOH-95%乙醇溶液50 mL，攪拌下加熱回流2 h，皂化微藻油脂中的可皂化物；加入蒸餾水20 mL，冷卻后加入25 mL正己烷分2次洗滌燒瓶，萃取分離皂化液中的不皂化物，萃取液用蒸餾水洗滌2次，并將洗滌水與斜三口圓底燒瓶中的萃余液合并，蒸出合并液中的乙醇，至燒瓶中無(wú)氣泡為止；在60 ℃下用1.5 mol/L HCl溶液50 mL酸化合并液，反應(yīng)時(shí)間為30 min，然后靜置冷卻；將酸化后的溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用20 mL正己烷洗滌燒瓶2次，并將洗滌液移入漏斗中靜置分層，將下層甘油酸水轉(zhuǎn)移到另一個(gè)500 mL分液漏斗中，加20 mL正己烷進(jìn)行萃取，如此萃取2次后，將得到的正己烷溶液合并于一個(gè)分液漏斗中，用50 mL去離子水洗滌得到的脂肪酸，直至洗液加甲基橙指示劑不變色為止；將得到的脂肪酸正己烷溶液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，蒸發(fā)回收正己烷，干燥脂肪酸得到微藻油脂中可皂化的總脂肪酸質(zhì)量（記錄其質(zhì)量m2）。

總脂肪酸含量（F）計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻油脂含量的標(biāo)定

對(duì)微擬球藻和小球藻分別采用水熱法、超聲法和索氏提取法進(jìn)行微藻油脂的提取，兩種微藻得到的微藻總脂含量見(jiàn)表1。

從表1可以看出，采用不同方法提取的微藻油脂含量差異較大，分析原因，主要是不同方法對(duì)微藻的破碎提取效率有所差異，其中以索氏抽提法得到的微藻油脂含量最高，水熱法次之，超聲法最低。另外，不同批次的微藻油脂含量有所不同，這是因?yàn)槲⒃宓酿B(yǎng)殖環(huán)境，如氮源、生長(zhǎng)溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽等因素都對(duì)微藻中油脂的含量及組成有較大影響，由于原料的生產(chǎn)及供應(yīng)條件，在以后的實(shí)驗(yàn)中使用序號(hào)為1、3的微藻作為實(shí)驗(yàn)原料。其中由于采用索氏抽提法提取的油脂較為充分，因此在以后的微藻油脂提取實(shí)驗(yàn)中均將水酶法提取到的微藻油脂與索氏抽提法提取的微藻油脂作對(duì)比。

2.2 纖維素酶對(duì)微藻油脂提取的研究

在微藻細(xì)胞壁中，內(nèi)外層中均存在大量的纖維素及半纖維素等，纖維素酶可以降解微藻細(xì)胞壁中的纖維素骨架，崩潰細(xì)胞壁，使油脂游離出來(lái)[17]，因此首先采用纖維素酶對(duì)微藻進(jìn)行酶解反應(yīng)。采用纖維素酶對(duì)微藻酶解后所得到的油脂提取率見(jiàn)表2。

表1 索氏抽提法提取微藻油脂的含量

表2 纖維素酶對(duì)微藻酶解后的油脂提取率

從表2可以看出，與未加入纖維素酶的處理相比，加入纖維素酶后可以大幅提高兩種微藻的油脂提取率，這說(shuō)明加入纖維素酶有利于微藻的破壁。以微擬球藻為例，對(duì)微藻酶解前后進(jìn)行掃描電鏡（SEM）分析對(duì)照，酶解前后微擬球藻的SEM照片如圖1所示。

從微擬球藻酶解前后的SEM照片可以看出，加入纖維素酶對(duì)微擬球藻酶解后，在掃描電鏡視野中已基本沒(méi)有完整的微藻細(xì)胞存在，微藻細(xì)胞已完全破碎，這說(shuō)明加入酶可以達(dá)到使微藻細(xì)胞壁破碎，這有助于微藻油脂的提取。

圖1 微擬球藻酶解前后SEM照片

2.3 酸堿預(yù)處理對(duì)微藻破壁油脂提取的影響

在微藻處理過(guò)程中，酸、堿既可以起到調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值的作用，同時(shí)又可以起到調(diào)節(jié)細(xì)胞壁內(nèi)外化學(xué)環(huán)境、軟化或降解纖維素等效果，因此，采用酸、堿輔助水熱處理等手段對(duì)微藻溶液預(yù)處理是水酶法提取植物油脂常用的輔助手段[18-19]。加入酸或堿在80 ℃下對(duì)微藻預(yù)處理后8 h，再調(diào)節(jié)pH值至5.0后加入纖維素酶酶解微藻所得到的油脂提取率見(jiàn)表3。從表3可以看出，采用酸堿預(yù)處理兩種微藻后，油脂提取率均明顯提高，可見(jiàn)采用酸堿預(yù)處理方式是有效的。其中采用堿預(yù)處理兩種微藻油脂的提取率均明顯高于用酸預(yù)處理的，并也遠(yuǎn)高于單獨(dú)使出堿預(yù)處理的，說(shuō)明了堿預(yù)處理和纖維素酶酶解聯(lián)合應(yīng)用可更有效地將兩種微藻油脂從細(xì)胞壁中游離出。在此后的微藻預(yù)處理過(guò)程中將采用堿預(yù)處理方式。

2.4 復(fù)合酶對(duì)微藻破壁油脂提取的影響

微藻的細(xì)胞壁成分除了纖維素、半纖維素，還含有果膠質(zhì)、藻酸鹽、藻多糖、聚半乳糖和硫酸酯等。而油脂在藻細(xì)胞內(nèi)部通常與其他大分子結(jié)合，構(gòu)成脂多糖和脂蛋白等復(fù)合體，并且不同微藻的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)也有所差異。因此，需要加入纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等組合，綜合考察不同酶組合對(duì)各種微藻的酶解效率。復(fù)合酶對(duì)兩種微藻油脂提取率的影響見(jiàn)表4。從表4可以看出，果膠酶、蛋白酶等可以輔助破碎微擬球藻細(xì)胞壁，復(fù)合酶的使用有助于提高微擬球藻油脂的提取率，當(dāng)纖維素酶、蛋白酶和果膠酶同時(shí)使用時(shí)，其油脂提取率提高到69.76%。但對(duì)小球藻來(lái)說(shuō)，復(fù)合酶的使用沒(méi)有促進(jìn)該微藻的油脂提取，反而有所降低，說(shuō)明小球藻的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與微擬球藻明顯不同，對(duì)生物酶的敏感性差異較大，三種生物酶的加入沒(méi)有產(chǎn)生協(xié)同作用，因此在后面的實(shí)驗(yàn)中處理微擬球藻將采用纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的組合，而小球藻只使用纖維素酶。

表3 預(yù)處理后纖維素酶酶解微藻的油脂提取率

表4 復(fù)合酶對(duì)微藻油脂收率的影響

2.5 萃取溶劑對(duì)微藻油脂提取的影響

在微藻油脂提取的過(guò)程中，可采用有機(jī)溶劑作為萃取溶劑將微藻細(xì)胞破壁后析出的油溶性物質(zhì)萃取出來(lái)?？紤]到有機(jī)溶劑與水相的互溶性較差，不利于微藻油脂的析出和萃取，因此在萃取過(guò)程中加入第二極性溶劑，提高有機(jī)溶劑與水相的有效接觸，從而提高微藻油脂的析出。不同有機(jī)溶劑以及有機(jī)溶劑和極性溶劑組合成雙溶劑體系對(duì)微藻油脂提取率的影響見(jiàn)表5。從表5可以看出，加入極性溶劑甲醇或乙醇后，明顯提高了兩種微藻油脂的提取率，表明雙溶劑體系可以協(xié)同作用，有效提取微藻中的極性及非極性油脂組份，特別是加入甲醇后，微藻油脂提取率明顯提高，這是因?yàn)榧状紝?duì)于微藻的滲透性更強(qiáng)，更有利于微藻油脂的析出。

2.6 微藻油脂的可皂化物及不可皂化物含量的測(cè)定

微藻細(xì)胞破壁后提取油脂時(shí)，采用不同有機(jī)溶劑所得到的微藻油脂的性質(zhì)也有一定差異。按照生物柴油可皂化物的測(cè)定方法可以測(cè)定所得油脂中可皂化物及不可皂化物的含量，表6中列出了分別采用正己烷-乙醇或三氯甲烷-乙醇體系萃取得到的兩種微藻油脂中可皂化物及不可皂化物的含量。從表6可以看出，采用正己烷-乙醇體系萃取的微藻油脂中可皂化物含量要較三氯甲烷-乙醇體系萃取的高，這也表明采用正己烷-乙醇雙溶劑體系萃取油脂有利于得到可皂化物含量更高的微藻油脂，有利于進(jìn)一步合成以微藻油脂為原料的微藻生物柴油。

表5 萃取溶劑對(duì)提取微藻油脂的影響

表6 不同溶劑萃取的微藻油脂中皂化物含量

2.7 微藻油脂中脂肪酸的成分分析

微藻油脂不易被汽化，特別是所提取的微藻油脂中含有甾醇、色素以及三甘油酯等成分，因此要對(duì)微藻油脂中的多不飽和脂肪酸進(jìn)行分析比較困難，通常要把所提取的微藻油脂皂化、甲酯化后再進(jìn)行氣相色譜分析[21]。將得到的微藻油脂分離可皂化物甲酯化后得到的脂肪酸分析結(jié)果見(jiàn)表7。

從表7可以看出，所提取的微藻油脂包含的脂肪酸種類(lèi)較多，其主要成分是棕櫚酸（C16：0）、棕櫚油酸（C16：1）、十八碳烯酸（C18：1）、二十碳五烯酸（C20：5）及亞油酸（C18：2）等，特別是C20以上的長(zhǎng)鏈脂肪酸，如：花生四烯酸ARA（C20：4）含量達(dá)2.8%以上，二十碳五烯酸EPA（C20：5）含量超過(guò)10%，這些物質(zhì)是普通動(dòng)植物油脂所不能提供的，對(duì)人體有益的脂肪酸成分，因此，微藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)對(duì)于人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)乃至CO2減排都是一項(xiàng)前景廣寬的產(chǎn)業(yè)。

3 結(jié)論

綜合以上結(jié)果可知，堿法預(yù)處理和水酶法聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于微擬球藻和小球藻細(xì)胞破壁提高油脂提取率具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。采用正己烷-乙醇作為萃取溶劑替代傳統(tǒng)使用的三氯甲烷為基礎(chǔ)萃取溶劑，對(duì)于兩種微藻油脂的提取仍然具有較好的效果，并可以萃取更多的可皂化物，有利于后續(xù)生物柴油的加工。在較低的溫度下（低于100 ℃），微擬球藻的油脂提取率可達(dá)90%以上，而更難破碎的小球藻油脂也可達(dá)50%以上，實(shí)現(xiàn)了兩種微藻的高效節(jié)能提取。對(duì)微藻油脂中多不飽和脂肪酸的分析結(jié)果表明，小球藻、微擬球藻的藻油中含有豐富的C20以上的長(zhǎng)鏈脂肪酸，特別是EPA、ARA等組分含量較高，是對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分，體現(xiàn)了微藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的綠色、環(huán)保等社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本研究中的相關(guān)方法和結(jié)果對(duì)促進(jìn)微擬球藻和小球藻油脂提取的規(guī)模化應(yīng)用，具有一定的借鑒意義。

表7 微藻油脂中的脂肪酸組成（w）/%