聶園軍 李瑞珍 趙佳 薄曉峰

摘 要： 為明確根際微生物群落演替變化與西瓜連作之間的關系，調查2014—2016年連續(xù)3 a（年）種植西瓜的產量和發(fā)病情況，并利用Illumina Miseq平臺對連作西瓜根際土壤微生物群落進行擴增子測序分析。結果表明，連續(xù)3 a種植西瓜其產量顯著降低而枯萎病發(fā)病率和病情指數顯著提高。不同種植年限根際微生物群落多樣性存在顯著差異，西瓜的連年種植打破了其根際微生物群落原有的平衡，使得細菌群落多樣性下降而真菌群落多樣性上升。在門水平上，Proteobacteria、Acidobacteria和Ascomycota的相對豐度升高，而Firmicutes、Actinobacteria、Gemmatimonadetes和Chytridiomycota的相對豐度下降。在屬水平上，Bacillus，Lysobacter與Pseudomonas等許多有益微生物相對豐度降低而病原菌所在的Fusarium相對豐度增加，最終表現為西瓜枯萎病爆發(fā)，產量降低。

關鍵詞： 西瓜； 根際微生物群落； 擴增子測序； 連作障礙

Abstract： Watermelon rhizosphere soil were taken as the experiment objectives， we explored the relationship between rhizosphere microbial communities and continuous cropping. The relationships between yield and disease of watermelon from 2014 to 2016 were investigated. Nine soil samples from three years were sequenced using Illumina Miseq. The continuous cropping decreased the yield， increased the disease incidence and disease index. The diversity of rhizosphere microbial communities in different years were significant difference. The balance of rhizosphere microbial communities was broken because of continuous cropping of watermelon， which resulted the reduction of bacteria community diversity and the increase of fungal community diversity. At the phyla level， the relative abundance of Proteobacteria，Acidobacteria and Ascomycota increased， while the relative abundance of Firmicutes，Actinobacteria，Gemmatimonadetes and Chytridiomycota decreased. At the genus level， some beneficial microbes like Bacillus， Lysobacter， and Pseudomonas decreased and pathogenic microbes （Fusarium） increased. Finally， the Fusarium wilt outbroke and the yield decreased.

Key words： Watermelon； Rhizosphere microbial communities； Amplifier sequencing； Continuous cropping obstacle

我國人均耕地面積較少，經濟作物連續(xù)多年在同一地塊種植的連作模式非常普遍，而多年的連作常引起作物生長受阻、土傳病害頻發(fā)[1-3]。西瓜是世界上重要的園藝作物之一，我國栽培總面積為180.15萬hm2，年產量約為7 071.3萬 t[4]?？菸『κ俏鞴线B作過程中最主要病害之一，它是由尖孢鐮刀菌西瓜?；虵usarium oxysporum f. sp. niveum侵染引起的一種土傳真菌病害，在西瓜各個生育期都可能發(fā)病，尤以坐果期和膨瓜期發(fā)病最重[5-7]?？菸∈沁B作西瓜產量降低和品質下降的重要原因[8-9]。因此，弄清連作西瓜根際微生物群落演替變化與西瓜生長、病害發(fā)生之間的互作關系，是解決西瓜連作障礙的關鍵。

根際土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)持續(xù)發(fā)揮作用的重要媒介，是反應土壤健康狀態(tài)的重要指標[10]。目前，國內外對根際微生物群落的研究主要集中在細菌群落上，根際真菌群落報道較少，如Ling等[9]研究了西瓜連作條件下施用不同肥料根際細菌群落的變化情況；肖蓉等[11]研究了患炭疽病草莓與健康草莓根際土壤細菌群落的多樣性，這些研究沒有系統(tǒng)地反映根際微生物群落整體的演替變化。在根際微生物的研究中，基因測序技術已成為主流，對根際的細菌和真菌群落都可以進行系統(tǒng)的分析。擴增子高通量測序技術通過提取根際土壤微生物總DNA，擴增其中的特異性片段并進行測序分析，測序結果由于可精確定位到種屬而被科研人員廣泛應用[12-13]。郝海婷等[14]利用Illumina MiSeq測序平臺研究了堆肥與化肥對蘭州百合根際土壤微生物群落的影響，物種注釋結果顯示細菌的門、綱、目、科、屬的數量在施用堆肥的土壤中都大于施用化肥的土壤。擴增子高通量測序技術無需對根際微生物進行培養(yǎng)，具有周期短、精度高的優(yōu)點，是研究根際微生物群落的有效手段。

筆者以連作西瓜根際微生物群落為研究對象，利用擴增子高通量測序技術從整體上分析西瓜連作過程中根際微生物群落變化情況，并與西瓜產量和病害等因子進行關聯(lián)分析，找出影響西瓜生長的關鍵菌群，明晰根際微生物群落演替變化與西瓜連作障礙之間的關系，為克服西瓜連作障礙提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：西瓜品種為‘早佳（8424），由山西省農業(yè)科學院植物保護研究所提供。

試劑及儀器：美國OMEGA公司E.Z.N.A. Soil DNA Isolation kit試劑盒、瓊脂糖試劑盒、 Qubit 2.0 DNA 檢測試劑盒，上海派森諾生物科技有限公司。DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；BG-gdsAUTO凝膠成像儀，北京百晶生物技術有限公司；Illumina Miseq平臺測序，上海派森諾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 西瓜連作田間試驗及土樣采集 2014—2016年在山西省晉中市山西省農業(yè)科學院東陽基地進行西瓜連作試驗。該試驗田從未種植過西瓜，2013年種植作物為玉米。2014年種植西瓜前，試驗田土壤有機質含量（w，后同）16.59 g·kg-1，全氮含量1.98 g·kg-1，有效磷含量16.43 mg·kg-1，有效鉀含量232 mg·kg-1，pH 7.08。西瓜品種為‘早佳（8424），每年3月25號營養(yǎng)缽育苗，35 d左右2葉1心時移栽到試驗田，6月25號左右開始采收；分3個小區(qū)，每個小區(qū)寬5 m長10 m，小區(qū)間隔5 m，面積為50 m2，寬窄行種植，寬行行距2 m，窄行0.5 m，株距0.8 m，常規(guī)水肥管理。連續(xù)種植3 a，每年種植前每個小區(qū)施入10 kg復合肥（mN∶mP∶mK=15∶15∶15）。

每年西瓜收獲后，用土鉆在每個小區(qū)隨機選擇5處根際土壤每處100 g，采集深度為15～20 cm，均勻地混合為一個樣品，然后裝密封袋低溫帶回實驗室，去除植物根系和石塊并過2 mm篩后于-20 ℃冰箱保存，備用；每年采集3個土壤樣品，連續(xù)3 a共采集9個樣品。

1.2.2 連作西瓜病害調查及產量統(tǒng)計 每年西瓜收獲前7 d對試驗小區(qū)內的所有西瓜植株進行觀察，記錄枯萎病的發(fā)生情況，計算發(fā)病率和病情指數[15-16]。發(fā)病率=發(fā)病株數/總植株數×100%。病害等級劃分標準：0級-整株無癥狀；1級-整株無變黃葉片；2級-1～2個葉片萎蔫；3級-全株>1/3葉片萎蔫；4級-全株>1/2葉片萎蔫；5級-全株>3/4葉片萎蔫或死亡。病情指數=Σ（病害等級×該級對應植株數）/總植株數。每年收獲期，各小區(qū)西瓜分批全部采收、稱量，按小區(qū)統(tǒng)計產量。

1.2.3 土壤DNA提取、PCR擴增和高通量測序 利用E.Z.N.A. Soil DNA Isolation kit 試劑盒參照其使用說明書提取土壤樣品DNA[17]。對細菌16S rDNA基因V3-V4高變區(qū)進行PCR擴增，引物序列分別為341F（CCTACGGGNGGCWGCAG） 和 805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）；對真菌NS1-FUNGAL區(qū)域進行PCR擴增，引物序列分別為NS1（GTAGTCATATGCTTGTCTC）和FUNGAL（ATTCCCCGTTACCCGTTG）[18]。擴增反應程序：94℃預變性5 min；30個循環(huán)（94 ℃ 45 s；55 ℃ 30 s（16S）/58.5 ℃ 45 s（18S）；72 ℃ 1 min）；72 ℃ 5 min。對PCR產物進行瓊脂糖電泳，并采用瓊脂糖試劑盒回收，然后用 Qubit 2.0 DNA 檢測試劑盒對回收的DNA 精確定量，每個處理DNA取10 ng，最后按1∶1等量混合后采用Illumina Miseq平臺進行測序[19]。

1.2.4 可操作分類單元聚類與物種分類分析 利用Fast QC軟件對測序原始數據進行質量控制，然后拼接、過濾掉低質量的序列，而后基于這些高質量序列進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，并將 OTU和物種注釋結合，從而得到每個樣品的OTUs 和分類譜系的基本分析結果[20]。對物種注釋后，對門和屬的分類水平上對相對豐度大于等于1%的優(yōu)勢物種進行群落結構的統(tǒng)計分析，明晰物種構成。

1.2.5 微生物群落Alpha多樣性分析 利用Mothur軟件進行微生物群落的Alpha多樣性分析，包括稀釋性曲線、Chao1指數和香濃指數[21-23]。稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定測序量的數據，統(tǒng)計它們所代表物種數目，即OTUs 數目，用數據量與物種數所構建的曲線；當曲線趨向平坦時表明樣品的測序數據量漸進合理，并間接反映樣品中物種的豐富程度。Chao1指數和香濃指數是衡量群落多樣性的重要指標，指數越大，群落的豐富度和多樣性越高。

1.2.6 土壤樣品與環(huán)境因子相關性分析 利用冗余分析技術（redundancy analysis，RDA）對土壤樣品與微生物群落（門水平）和西瓜病害及產量這些環(huán)境因子進行相關性分析[24]。通過RDA分析可將土壤樣品與環(huán)境因子數據互相擬合，并通過置換檢驗來判斷環(huán)境因子與土壤樣品、環(huán)境因子與環(huán)境因子之間的影響是否顯著。RDA分析可以將樣品和環(huán)境因子反映在同一個二維排序圖上，從圖中可以直觀地看出樣品分布和環(huán)境因子間的關系，確定微生物群落在不同年份的消長變化，明晰顯著影響西瓜病害和產量的菌群。

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，應用鄧肯氏新復極差法檢驗（Duncans new multiple range tests）進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 連作西瓜的枯萎病發(fā)病情況及產量

由表1可知，隨著種植年限的增加，西瓜的發(fā)病率和病情指數逐年上升而產量逐年下降，且不同年份間差異顯著。2014年，西瓜的發(fā)病率極低僅為2%，產量表現正常。而連續(xù)種植3 a后，西瓜枯萎病爆發(fā)，發(fā)病率與病情指數急速上升，分別達到61.3% 和1.87，而小區(qū)產量嚴重下降僅有102.6 kg，為第1年產量的29%。

2.2 微生物群落分類分析

在門水平，2014—2016年連作西瓜根際土壤微生物群落的優(yōu)勢物種出現消長變化。從細菌群落看，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）是所有樣品中相對豐度≥1%的10個優(yōu)勢門，變形菌門與酸桿菌門的相對豐度隨著連作年限的增加而逐漸升高，而厚壁菌門、放線菌門與芽單胞菌門的相對豐度隨著連作年限的增加而逐漸下降（圖版A，見彩色插頁第12頁）。從真菌群落看，壺菌門（Chytridiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、子囊菌門（Ascomycota）、纖毛菌門（Ciliophora）、擔子菌門（Basidiomycota）、絲足菌門（Cercozoa）、球囊菌門（Glomeromycota）與羅茲菌門（Rozellomycota）是所有樣品中相對豐度≥1%的8個優(yōu)勢門，其中子囊菌門的相對豐度在3 a中均在70%以上，超過其它微生物群落之和，處于支配地位。隨著連作年限的增加，子囊菌門的相對豐度逐漸升高，而壺菌門的相對豐度逐漸降低（圖版B，見彩色插頁第12頁）。

在細菌屬水平，相對豐度處于前10位的優(yōu)勢屬中，在連作3 a后芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、溶桿菌屬（Lysobacter）、土壤紅桿菌科（Solirubrobacter）、德沃斯氏菌屬（Devosia）與假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度處于最低值；而浮霉菌屬（Planctomyces）和豐祐菌屬（Opitutus）的相對豐度處于最高值（圖版C，見彩色插頁第12頁）。在真菌屬水平，相對豐度處于前10位的優(yōu)勢屬中，在連作3 a后尖孢鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）與疣孢漆斑菌（Myrothecium）的相對豐度處于最高值；而紅根菌屬（Rhizophlyctis）的相對豐度處于最低值。最重要的是，西瓜枯萎病病原菌所在的尖孢鐮刀菌屬，連作3 a后相對豐度最高（圖版D，見彩色插頁第12頁）。

2.3 連作西瓜土壤微生物群落的多樣性分析

2.3.1 稀釋曲線分析 9個樣品中，細菌16S rRNA序列總數為436 187（45 603-64 320）；真菌NS1–FUNGAL序列總數為310 734（25 341-83 499）。土壤樣本細菌和真菌隨著序列數的增加的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序量已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。隨著種植年限的增加西瓜根際土壤中細菌群落的OTUs顯著降低（圖1-A）；與之相反真菌群落的OTUs隨著種植年限的增加而升高（圖1-B）。

2.3.2 Chao1指數和香濃指數分析 連作西瓜根際土壤樣品中細菌的Chao1指數和香濃指數總體上均高于真菌，細菌在土壤微生物中占主體地位，微生物群落Chao1指數和香濃指數因種植年限不同而產生顯著差異；細菌群落的Chao1指數和香濃指數隨種植年限的增加而顯著降低，在連作3 a后達到最低值（4 254.817和8.857）；而真菌群落的Chao1指數和香濃指數隨種植年限的增加而顯著升高，在連作3 a后達到最高值（641.462和6.246）。西瓜根際土壤中的細菌和真菌群落多樣性隨連作年限的增加呈現此消彼長的趨勢（表2）。

2.4 土壤樣品與環(huán)境因子相關性分析

將樣品、環(huán)境因子進行關聯(lián)分析（圖2），不論細菌類群還是真菌類群，不同連作年限的樣品各自分開，產量與2014年的3個樣品呈正相關，而與2016年的3個樣品呈負相關；發(fā)病率和病情指數的結果與之相反。從細菌類群看，厚壁菌門、Actinobacteria和Gemmatimonadetes及產量因子和2014年的3個樣品呈正相關，而與發(fā)病率、病情指數、2016年的3個樣品呈負相關；Proteobacteria、Acidobacteria和Planctomycetes的結果與之相反。從真菌類群看，Chytridiomycota和Glomeromycota及產量因素和2014年的3個樣品呈正相關，而與發(fā)病率、病情指數、2016年的3個樣品呈負相關；而Ascomycota、Ciliophora、Basidiomycota和Cercozoa的結果與之相反。

3 討 論

根際土壤微生物群落是反應土壤健康狀況的重要指標之一，不同的農業(yè)耕作模式會影響根際土壤微生物多樣性甚至作物的生長[25-26]。西瓜連作對土壤的影響同樣反應在根際微生物群落的變化上。從西瓜根際微生物門、屬水平物種分類上看，所有土壤樣品中的物種類群大體相似但在相對豐度上差別很大，Li等[8]在番茄的研究中也有類似報道。這說明種植的作物或農藝條件不同對微生物的物種類群的影響不顯著，但對物種相對豐度的影響尤為顯著。如：Bacillus、Lysobacter與Pseudomonas的相對豐度隨著連作年限的增加而迅速降低，而西瓜枯萎病病原菌所在的屬Fusarium隨著連作年限的增加而迅速累積。Bacillus能分泌多抗菌物質來拮抗土傳病原菌，從而保護植株不受侵害[27-28]。Lysobacter也被證明有拮抗病原菌和促進植株生長的作用[29]。Rumberger等[30]報道，Pseudomonas與植株生長密切相關。因此，可以確認Bacillus、Lysobacter與Pseudomonas這些有益微生物相對豐度的降低和Fusarium相對豐度的升高，與西瓜枯萎病害的發(fā)生呈正相關。

通過對稀釋性曲線、Chao1指數和香濃指數的分析發(fā)現，西瓜根際微生物群落中細菌群落占優(yōu)勢地位，但隨著連作年限的增加呈現細菌群落多樣性降低而真菌群落多樣性升高的現象。這說明微生物群落結構有從細菌性向真菌性轉變的趨勢。這一現象在很多研究中得到確認，如Luo和Shen等[31-32]發(fā)現細菌群落多樣性與連作年限成反比，而真菌群落多樣性與連作年限成正比。本試驗亦證明了低豐度的細菌群落多樣性和高豐度的真菌群落多樣性與西瓜枯萎病害呈正相關。

冗余分析說明西瓜根際微生物類群的演替變化與連作年限、病害發(fā)生和產量情況息息相關。Proteobacteria、Acidobacteria和Ascomycota相對豐度的增加會抑制西瓜生長，使得枯萎病病情逐年惡化；與之相反Firmicutes、Actinobacteria、Gemmatimonadetes和Chytridiomycota這些菌群的存在會促進西瓜生長，抑制病害發(fā)生。這再次證明了在連續(xù)種植西瓜這一外界刺激影響下，根際微生物群落發(fā)生了定向改變，某些有益微生物減少而土傳病原微生物增加了，而這種變化也影響到了西瓜的農藝性狀，使得連作狀態(tài)下西瓜病害爆發(fā)、產量下降，而連作狀態(tài)下的黑椒和桃等作物都有相似的報道[33-34]。以上結果提示我們，增加土壤中有拮抗作用或促生作用的有益微生物含量，抑制病原菌的生長，使微生物群落結構由“真菌型”轉變回“細菌型”，是減少枯萎病危害的有效途徑。

本研究明確了西瓜根際促生抑病功能菌群的物種定位，為篩選功能菌株提供了思路。在今后的研究中，應進一步縮短采樣時間間隔，更加精確的分析西瓜連作過程中微生物群落的動態(tài)變化，從而為克服西瓜連作障礙提供理論依據。

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