(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 杭州 310058)

基因敲除小鼠是在C57BL/6品系小鼠上，敲除了機(jī)體產(chǎn)生組織蛋白酶 S(cathepsin s)和胱抑素C(Cystatin C)的相關(guān)基因后培育成的新品系。本試驗(yàn)的目的通過(guò)與 C57BL/6比較，探索敲除了這兩個(gè)基因后是否會(huì)影響小鼠的生長(zhǎng)繁育。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源 Cystatin C-null小鼠(C-C)和Cathepsin S-null小鼠(C-S)是美國(guó)哈佛大學(xué)Guo Ping shi 教授研制培育的基因敲除小鼠。 2005年11月份，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院的項(xiàng)美香教授獲得哈佛大學(xué)的贈(zèng)送，引進(jìn)了兩對(duì)種鼠，飼養(yǎng)在學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。經(jīng)繁殖后動(dòng)物數(shù)量： Cystatin C-null(C-C)雌性小鼠193只，雄性小鼠：199只；Cathepsin S-null(C-S)雌性小鼠183只，雄性小鼠179只。

1.1.2飼料和水 浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自己配制生產(chǎn)的全價(jià)飼料，經(jīng)121℃、20 min、真空高壓蒸汽滅菌。營(yíng)養(yǎng)成分含量(%)：粗蛋白22.1、粗脂肪5.3、粗纖維3、鈣1.25、總磷0.75、能量(kcal/100 g)352、維生素A(IU/kg)27433。水是標(biāo)準(zhǔn)城市飲用水經(jīng)121℃，50 min真空高壓蒸汽滅菌。

1.1.3儀器 BP98A-血壓儀，動(dòng)物心電圖分析儀(日本軟隆公司)，動(dòng)物血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，羅氏全自動(dòng)生化儀。

1.2研究方法

1.2.1飼養(yǎng) 飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內(nèi)。空氣為高效過(guò)濾(7級(jí))，溫度19～26℃，濕度40%～60%,12 h/12 h交替照明，噪音≤60 dB，換氣次數(shù)在15～20次/h，墊料為軟木刨花經(jīng)高溫高壓處理，一周更換一次。

1.2.2繁殖 雄鼠8-9周齡，雌鼠7-8周齡時(shí)配種。嚴(yán)格的兄妹交配，1雌1雄長(zhǎng)期同窩。仔鼠初生之日起，每周測(cè)定體重，至15周齡止，仔鼠在3-4周齡后離開(kāi)母鼠，按性別分籠飼養(yǎng)。

1.2.3數(shù)據(jù)采集 記錄1-5胎的生長(zhǎng)、繁殖性能。

2 結(jié)果

2.1生長(zhǎng)性能

圖1 基因敲除小鼠的生長(zhǎng)性能 注：系列1：C-S雌性小鼠；系列2：C-S雄性小鼠；系列3：C-C雌性小鼠；系列4：C-C雄性小鼠

2.2繁殖性能 基因敲除小鼠的繁殖性能見(jiàn)表1。

2.3血液常規(guī)指標(biāo) 基因敲除小鼠的血液常規(guī)指標(biāo)見(jiàn)表2。

2.4血液生化指標(biāo) 基因敲除小鼠的血液生化指標(biāo)見(jiàn)表3。

3 討論與結(jié)論

3.1組織蛋白酶(cathepsin)是一大類裂解肽鍵的蛋白水解酶，其中組織蛋白酶S(cathepsin S)屬于半胱氨酸蛋白酶,其作用非常廣泛，參與機(jī)體多種生理、病理過(guò)程。它不但可收斂細(xì)胞的炎性壞死，還參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。Cystatin C(Cys C) 又稱半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，中譯名為胱抑素C， 是半胱氨酸蛋白酶的細(xì)胞外抑制劑，在cystatin 中含量最為豐富，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)換起作用。它廣泛存在于脊椎動(dòng)物的組織中，參與炎癥過(guò)程及一些神經(jīng)性疾病。因此，這兩類物質(zhì)成為近來(lái)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

表1 基因敲除小鼠的繁殖性能

注：C57BL/6*的有關(guān)數(shù)據(jù)來(lái)源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的網(wǎng)頁(yè)

表2 基因敲除小鼠的血液常規(guī)指標(biāo)

表3 血液生化指標(biāo)

3.2Cathepsin S-null小鼠和Cystatin C-null小鼠是美國(guó)哈佛大學(xué)Guo Ping shi 教授研制培育的基因敲除小鼠。它們是在C57BL/6品系小鼠上，敲除了機(jī)體產(chǎn)生組織蛋白酶S(cathepsin S)和胱抑素C(Cystatin C)的相關(guān)基因后培育成的新品系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲除這兩個(gè)基因后，對(duì)該品系小鼠的生長(zhǎng)繁殖性能沒(méi)有影響。

3.3兩品系之間的一些繁殖指標(biāo)如分娩間隔(d)、產(chǎn)仔數(shù)、成活率(%)等沒(méi)有多大差別，差異不顯著。但兩品系間在生長(zhǎng)速度上有差異。從第六周開(kāi)始， Cystatin C-null小鼠的生長(zhǎng)速度要比Cathepsin S-null小鼠生長(zhǎng)的快。兩者差異顯著。Cystatin C-null小鼠的繁育方法跟BALB/c裸小鼠的繁育方法類似，其親本是雜合子，根據(jù)遺傳學(xué)相關(guān)定律，約1/4的后代是敲除了含有胱抑素C(Cystatin C)相關(guān)基因的純合子小鼠。而Cathepsin S-null小鼠繁育方法跟C57BL/6近交小鼠的繁育方法一樣，只要嚴(yán)格的兄妹交配，其后代都是敲除了含有組織蛋白酶S(cathepsin S)相關(guān)基因的純合子小鼠。因此，我們推測(cè)，Cystatin C-null小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育要快于Cathepsin S-null小鼠，是否跟此有關(guān)。

3.4兩品系間的血常規(guī)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)等也沒(méi)有多大差別，差異不顯著。

3.5小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育跟周?chē)沫h(huán)境條件，如溫度、濕度、光照、噪音等和飼養(yǎng)，飲水的關(guān)系十分密切，甚至飼養(yǎng)員的喂養(yǎng)習(xí)慣都會(huì)影響到它們的生長(zhǎng)。因此，世界上各地方，各實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的小鼠情況是不一樣的，即使同一種品系，也會(huì)隨著環(huán)境的不同而出現(xiàn)差異。