王 剛 姚 雷 （上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市閔行區(qū) 200240）

李正娟 （上海聚公生物科技有限公司，上海市金山區(qū) 201505）

玫瑰屬薔薇科薔薇屬植物，其中苦水玫瑰為我國(guó)獨(dú)有品種，在我國(guó)已有200多年的種植歷史，該品種主要分布在甘肅省蘭州市永登縣苦水鎮(zhèn)[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，提取玫瑰精油是我國(guó)玫瑰的主要用途。近年來(lái)，由于精油市場(chǎng)緊俏，精油生產(chǎn)量上升，隨之帶來(lái)了其副產(chǎn)物花渣的排放量加大，這不僅給環(huán)境帶來(lái)了影響，還因花渣中可能含有大量的活性天然產(chǎn)物而造成巨大的資源浪費(fèi)。大量研究發(fā)現(xiàn)，作為生產(chǎn)精油副產(chǎn)物的玫瑰花渣，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、粗纖維、黃酮和多酚等活性物質(zhì)，其中，黃酮含量占3.13%[2]。而黃酮類(lèi)化合物具有多種醫(yī)療保健功能，是目前國(guó)際上開(kāi)發(fā)新藥物的研究重點(diǎn)。

目前，針對(duì)苦水玫瑰的研究主要集中在抗氧化成分的提取、純化及抗氧化活性研究，缺乏對(duì)苦水玫瑰花渣中有效成分利用價(jià)值的研究。因此，本研究從利用苦水玫瑰花渣提取總黃酮的可行性入手，采用硝酸鋁比色法對(duì)其總黃酮的含量進(jìn)行比較研究，同時(shí)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)其黃酮類(lèi)化合物的組成成分進(jìn)行分析和鑒定，以期為苦水玫瑰花渣的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為苦水玫瑰干花和大馬士革玫瑰干花，均購(gòu)于甘肅省蘭州市永登縣。供試藥劑為無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇（均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）和甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純，購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。儀器設(shè)備為101A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）、BJ-150高速多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）、JA1003上皿電子天平（上海精科天平）、3K15型sigma臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海珂淮儀器有限公司）、CU420電熱恒溫水箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SK7200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（SHIMADZU公司）、VION IMS QTOF MS超高效液相色譜-離子淌度-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（SHIMADZU公司）。

1.2 總黃酮含量的測(cè)定

1.2.1 玫瑰花渣的制備

稱(chēng)取苦水玫瑰干花和大馬士革玫瑰干花各500 g，采用水蒸氣蒸餾法提取精油，將精油除去后，經(jīng)紗布過(guò)濾除去廢水后殘留的浸渣即為玫瑰花渣。將浸渣置于干燥箱中，先于105 ℃下干燥15 min，再于70 ℃下烘干直至恒重。取恒重后的玫瑰花渣，經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩后收集干粉，于冰箱中冷藏保存，備用。

1.2.2 玫瑰花渣總黃酮粗提液的制備

用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣各0.500 0 g，加入一定體積的70%乙醇，置于65 ℃的恒溫水浴中加熱提取1 h后，再采用超聲波輔助提取20 min，之后將各粗提液置于離心機(jī)中離心20 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為10 000 r/min，收集濾渣，再次提取，將兩次經(jīng)離心得到的上清液合并，得到總黃酮提取液。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g于燒杯中，加入一定濃度的乙醇溶液進(jìn)行溶解，制備得到0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃的冰箱中，但擱置時(shí)間不能太長(zhǎng)。準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別倒入6個(gè)棕色容量瓶中（體積10 mL），再向各個(gè)容量瓶中分別加入70%乙醇溶液2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL，然后每個(gè)容量瓶中精密加入5% NaNO20.5 mL，混合均勻后于暗處?kù)o止放置6 min，之后再向各個(gè)容量瓶中分別加入10%Al(NO3)30.5 mL，混合均勻后于暗處?kù)o止放置6 min，最后向各瓶添加5%NaOH 4 mL，再向各瓶添加70%乙醇定容至刻度線，混合均勻后于暗處?kù)o止放置15 min，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定510 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣的總黃酮粗提液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，按照1.2.3的方法測(cè)定各個(gè)溶液的吸光度。根據(jù)1.2.3得到的曲線方程計(jì)算得出各玫瑰總黃酮的質(zhì)量濃度，然后計(jì)算各自的含量。計(jì)算公式：玫瑰總黃酮的含量（mg/g)=(C×V×N)÷M，式中，C為各粗提液中玫瑰總黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL），N為提取液的稀釋倍數(shù)，V為提取液體積（mL），M為原材料的質(zhì)量（g）。

1.3 黃酮結(jié)構(gòu)的測(cè)定

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)總黃酮的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定。

質(zhì)譜條件：儀器為ACQUITY UPLC級(jí)系統(tǒng)、VION IMS QTOF質(zhì)譜儀和DAD檢測(cè)器。

超高效液相色譜條件：采用的流動(dòng)相A是0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B是0.1%甲酸乙腈，采用線性梯度洗脫。注射量為0.1～1μm，流量為0.4 mL/min，溫度為45 ℃。

VION IMS QTOF MS的具體條件：采用正、負(fù)電噴霧電離(ESI)模式對(duì)LockSpray離子源進(jìn)行工作。在50～1 000 m/z范圍內(nèi)掃描，掃描速率為0.2 s/scan。用氬氣（99.999%）作為碰撞誘導(dǎo)解離氣體。

電噴霧震源參數(shù)：毛細(xì)管電壓2 kV（正模式）、參考毛細(xì)管電壓2.5 kV、錐電壓40 V、源偏移量60 V、熱源溫度115 ℃、脫溶劑氣體溫度450 ℃、脫溶劑氣體流量900 L/h、錐孔反吹氣流量50 L/h，其中脫溶劑氣體和錐孔反吹氣體是氮?dú)猓ǎ?99.5%）。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，使用UNIFI 1.8.1.軟件計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量的比較研究

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.075x+0.001，R2=0.9995。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和總黃酮含量計(jì)算公式獲得苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣的總黃酮含量分別為72.24 mg/g和43.82 mg/g，苦水玫瑰花渣的總黃酮含量幾乎是大馬士革玫瑰花渣中的2倍。以上結(jié)果表明，苦水玫瑰花渣中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，表明在黃酮含量方面，苦水玫瑰花渣具有重要的研究?jī)r(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 黃酮結(jié)構(gòu)的比較研究

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)能夠得到待測(cè)黃酮的總離子流色譜圖、黃酮組分的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，且從中可得到準(zhǔn)分子離子的分子量，并能分析計(jì)算出可能的分子式，同時(shí)還可得到可能的相應(yīng)化合物及其結(jié)構(gòu)。由圖2可知，圖譜顯示的分子離子峰較多，且每個(gè)峰的響應(yīng)值不同，這表明苦水玫瑰花渣中黃酮的組成成分較多，且不同組分的含量差異較大。同時(shí)，圖譜上響應(yīng)值較高的有十幾種，根據(jù)這些組成成分的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖所顯示的分子量、特征碎片離子和可能的結(jié)構(gòu)，再結(jié)合已報(bào)道的文獻(xiàn)，可以初步判定出各個(gè)組分的結(jié)構(gòu)，最終從玫瑰花渣的總黃酮中初步確定出13種含量較高的化合物，包括6種槲皮素的糖苷衍生物和7種山奈酚的糖苷衍生物，見(jiàn)表1。

由圖3可知，苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣含有相同的黃酮類(lèi)化合物，但含量不同；苦水玫瑰花渣中含有大馬士革玫瑰花渣中沒(méi)有的黃酮類(lèi)化合物；大馬士革玫瑰花渣中含有苦水玫瑰花渣中沒(méi)有的黃酮化合物。在20 000水平線以上峰值中，苦水玫瑰花渣黃酮峰值大于大馬士革玫瑰花渣黃酮峰值的數(shù)量為23個(gè)，大馬士革玫瑰花渣黃酮峰值大于苦水玫瑰花渣黃酮峰值的數(shù)量為10個(gè)，在峰值數(shù)量上，苦水玫瑰花渣占有明顯優(yōu)勢(shì)，表明這兩種玫瑰花渣黃酮的結(jié)構(gòu)有較顯著的差異。

圖2 苦水玫瑰花渣中黃酮的總離子流色譜圖

表1 玫瑰花渣中主要的黃酮類(lèi)化合物

本研究同時(shí)根據(jù)峰的保留時(shí)間、分子離子峰質(zhì)荷比、特征碎片離子、分子式和黃酮化合物的裂解模式，著重研究分析了苦水玫瑰花渣中含有（響應(yīng)值相對(duì)高的）而大馬士革玫瑰花渣中沒(méi)有的黃酮結(jié)構(gòu)。由表2可知，僅存在于苦水玫瑰花渣中的黃酮類(lèi)化合物主要是槲皮素和山奈酚的糖苷物質(zhì)。

圖3 苦水玫瑰花渣與大馬士革玫瑰花渣黃酮的總離子流色譜對(duì)比圖

表2 苦水玫瑰花渣中獨(dú)有的4種黃酮類(lèi)化合物

3 結(jié) 論

本研究采用硝酸鋁比色法對(duì)苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣的總黃酮含量進(jìn)行了比較，其含量分別為72.24 mg/g和43.82 mg/g；同時(shí)，應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣中黃酮的組成成分進(jìn)行了初步分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)兩種玫瑰花渣中提取的黃酮結(jié)構(gòu)有較顯著差異，有4種含量較高的黃酮結(jié)構(gòu)僅存在于苦水玫瑰花渣中。以上研究表明，利用苦水玫瑰花渣提取總黃酮在黃酮含量和結(jié)構(gòu)方面均具有一定的可行性。