王 剛 姚 雷 （上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市閔行區(qū) 200240）

李正娟 （上海聚公生物科技有限公司，上海市金山區(qū) 201505）

玫瑰屬薔薇科薔薇屬植物，其中苦水玫瑰為我國獨有品種，在我國已有200多年的種植歷史，該品種主要分布在甘肅省蘭州市永登縣苦水鎮(zhèn)[1]。長期以來，提取玫瑰精油是我國玫瑰的主要用途。近年來，由于精油市場緊俏，精油生產(chǎn)量上升，隨之帶來了其副產(chǎn)物花渣的排放量加大，這不僅給環(huán)境帶來了影響，還因花渣中可能含有大量的活性天然產(chǎn)物而造成巨大的資源浪費。大量研究發(fā)現(xiàn)，作為生產(chǎn)精油副產(chǎn)物的玫瑰花渣，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、粗纖維、黃酮和多酚等活性物質(zhì)，其中，黃酮含量占3.13%[2]。而黃酮類化合物具有多種醫(yī)療保健功能，是目前國際上開發(fā)新藥物的研究重點。

目前，針對苦水玫瑰的研究主要集中在抗氧化成分的提取、純化及抗氧化活性研究，缺乏對苦水玫瑰花渣中有效成分利用價值的研究。因此，本研究從利用苦水玫瑰花渣提取總黃酮的可行性入手，采用硝酸鋁比色法對其總黃酮的含量進(jìn)行比較研究，同時采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對其黃酮類化合物的組成成分進(jìn)行分析和鑒定，以期為苦水玫瑰花渣的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為苦水玫瑰干花和大馬士革玫瑰干花，均購于甘肅省蘭州市永登縣。供試藥劑為無水乙醇、無水甲醇（均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）和甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純，購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。儀器設(shè)備為101A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實驗儀器總廠）、BJ-150高速多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）、JA1003上皿電子天平（上海精科天平）、3K15型sigma臺式高速冷凍離心機(jī)（上海珂淮儀器有限公司）、CU420電熱恒溫水箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SK7200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（SHIMADZU公司）、VION IMS QTOF MS超高效液相色譜-離子淌度-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（SHIMADZU公司）。

1.2 總黃酮含量的測定

1.2.1 玫瑰花渣的制備

稱取苦水玫瑰干花和大馬士革玫瑰干花各500 g，采用水蒸氣蒸餾法提取精油，將精油除去后，經(jīng)紗布過濾除去廢水后殘留的浸渣即為玫瑰花渣。將浸渣置于干燥箱中，先于105 ℃下干燥15 min，再于70 ℃下烘干直至恒重。取恒重后的玫瑰花渣，經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩后收集干粉，于冰箱中冷藏保存，備用。

1.2.2 玫瑰花渣總黃酮粗提液的制備

用分析天平準(zhǔn)確稱取苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣各0.500 0 g，加入一定體積的70%乙醇，置于65 ℃的恒溫水浴中加熱提取1 h后，再采用超聲波輔助提取20 min，之后將各粗提液置于離心機(jī)中離心20 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為10 000 r/min，收集濾渣，再次提取，將兩次經(jīng)離心得到的上清液合并，得到總黃酮提取液。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g于燒杯中，加入一定濃度的乙醇溶液進(jìn)行溶解，制備得到0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃的冰箱中，但擱置時間不能太長。準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別倒入6個棕色容量瓶中（體積10 mL），再向各個容量瓶中分別加入70%乙醇溶液2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL，然后每個容量瓶中精密加入5% NaNO20.5 mL，混合均勻后于暗處靜止放置6 min，之后再向各個容量瓶中分別加入10%Al(NO3)30.5 mL，混合均勻后于暗處靜止放置6 min，最后向各瓶添加5%NaOH 4 mL，再向各瓶添加70%乙醇定容至刻度線，混合均勻后于暗處靜止放置15 min，在紫外-可見分光光度計上測定510 nm波長處的吸光度值，最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確吸取苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣的總黃酮粗提液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，按照1.2.3的方法測定各個溶液的吸光度。根據(jù)1.2.3得到的曲線方程計算得出各玫瑰總黃酮的質(zhì)量濃度，然后計算各自的含量。計算公式：玫瑰總黃酮的含量（mg/g)=(C×V×N)÷M，式中，C為各粗提液中玫瑰總黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL），N為提取液的稀釋倍數(shù)，V為提取液體積（mL），M為原材料的質(zhì)量（g）。

1.3 黃酮結(jié)構(gòu)的測定

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用法對總黃酮的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定。

質(zhì)譜條件：儀器為ACQUITY UPLC級系統(tǒng)、VION IMS QTOF質(zhì)譜儀和DAD檢測器。

超高效液相色譜條件：采用的流動相A是0.1%甲酸水溶液，流動相B是0.1%甲酸乙腈，采用線性梯度洗脫。注射量為0.1～1μm，流量為0.4 mL/min，溫度為45 ℃。

VION IMS QTOF MS的具體條件：采用正、負(fù)電噴霧電離(ESI)模式對LockSpray離子源進(jìn)行工作。在50～1 000 m/z范圍內(nèi)掃描，掃描速率為0.2 s/scan。用氬氣（99.999%）作為碰撞誘導(dǎo)解離氣體。

電噴霧震源參數(shù)：毛細(xì)管電壓2 kV（正模式）、參考毛細(xì)管電壓2.5 kV、錐電壓40 V、源偏移量60 V、熱源溫度115 ℃、脫溶劑氣體溫度450 ℃、脫溶劑氣體流量900 L/h、錐孔反吹氣流量50 L/h，其中脫溶劑氣體和錐孔反吹氣體是氮氣（＞ 99.5%）。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，使用UNIFI 1.8.1.軟件計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量的比較研究

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.075x+0.001，R2=0.9995。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和總黃酮含量計算公式獲得苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣的總黃酮含量分別為72.24 mg/g和43.82 mg/g，苦水玫瑰花渣的總黃酮含量幾乎是大馬士革玫瑰花渣中的2倍。以上結(jié)果表明，苦水玫瑰花渣中含有豐富的黃酮類化合物，表明在黃酮含量方面，苦水玫瑰花渣具有重要的研究價值和經(jīng)濟(jì)效益。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 黃酮結(jié)構(gòu)的比較研究

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)能夠得到待測黃酮的總離子流色譜圖、黃酮組分的一級和二級質(zhì)譜圖，且從中可得到準(zhǔn)分子離子的分子量，并能分析計算出可能的分子式，同時還可得到可能的相應(yīng)化合物及其結(jié)構(gòu)。由圖2可知，圖譜顯示的分子離子峰較多，且每個峰的響應(yīng)值不同，這表明苦水玫瑰花渣中黃酮的組成成分較多，且不同組分的含量差異較大。同時，圖譜上響應(yīng)值較高的有十幾種，根據(jù)這些組成成分的一級、二級質(zhì)譜圖所顯示的分子量、特征碎片離子和可能的結(jié)構(gòu)，再結(jié)合已報道的文獻(xiàn)，可以初步判定出各個組分的結(jié)構(gòu)，最終從玫瑰花渣的總黃酮中初步確定出13種含量較高的化合物，包括6種槲皮素的糖苷衍生物和7種山奈酚的糖苷衍生物，見表1。

由圖3可知，苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣含有相同的黃酮類化合物，但含量不同；苦水玫瑰花渣中含有大馬士革玫瑰花渣中沒有的黃酮類化合物；大馬士革玫瑰花渣中含有苦水玫瑰花渣中沒有的黃酮化合物。在20 000水平線以上峰值中，苦水玫瑰花渣黃酮峰值大于大馬士革玫瑰花渣黃酮峰值的數(shù)量為23個，大馬士革玫瑰花渣黃酮峰值大于苦水玫瑰花渣黃酮峰值的數(shù)量為10個，在峰值數(shù)量上，苦水玫瑰花渣占有明顯優(yōu)勢，表明這兩種玫瑰花渣黃酮的結(jié)構(gòu)有較顯著的差異。

圖2 苦水玫瑰花渣中黃酮的總離子流色譜圖

表1 玫瑰花渣中主要的黃酮類化合物

本研究同時根據(jù)峰的保留時間、分子離子峰質(zhì)荷比、特征碎片離子、分子式和黃酮化合物的裂解模式，著重研究分析了苦水玫瑰花渣中含有（響應(yīng)值相對高的）而大馬士革玫瑰花渣中沒有的黃酮結(jié)構(gòu)。由表2可知，僅存在于苦水玫瑰花渣中的黃酮類化合物主要是槲皮素和山奈酚的糖苷物質(zhì)。

圖3 苦水玫瑰花渣與大馬士革玫瑰花渣黃酮的總離子流色譜對比圖

表2 苦水玫瑰花渣中獨有的4種黃酮類化合物

3 結(jié) 論

本研究采用硝酸鋁比色法對苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣的總黃酮含量進(jìn)行了比較，其含量分別為72.24 mg/g和43.82 mg/g；同時，應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對苦水玫瑰花渣和大馬士革玫瑰花渣中黃酮的組成成分進(jìn)行了初步分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)兩種玫瑰花渣中提取的黃酮結(jié)構(gòu)有較顯著差異，有4種含量較高的黃酮結(jié)構(gòu)僅存在于苦水玫瑰花渣中。以上研究表明，利用苦水玫瑰花渣提取總黃酮在黃酮含量和結(jié)構(gòu)方面均具有一定的可行性。