張佳星，平 勇

(上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

隨著社會的進(jìn)步，人們對于健康的重視不斷加強(qiáng)，各項生物學(xué)研究也在不斷更新著我們對于健康及壽命的認(rèn)識，然而生物鐘的重復(fù)相移對健康的影響卻少有研究[1].現(xiàn)今，跨時區(qū)旅行以及輪班工作已司空見慣，由此我們難免會產(chǎn)生時差反應(yīng).受時差反應(yīng)困擾的人不在少數(shù)，而經(jīng)?？鐣r區(qū)出行使得人們不由擔(dān)心自己的身體健康，擔(dān)心記憶力衰退、身體代謝水平下降等一系列問題[2].我們已知時差反應(yīng)會降低神經(jīng)敏銳度，導(dǎo)致許多疾病的患病風(fēng)險提高，其中一些疾病的患病幾率會隨著時間的推移日益累積，從而導(dǎo)致對身體健康的累積性傷害，因此也就提高了探究時差反應(yīng)對健康影響的必要性[3].毫無疑問，哺乳動物和果蠅的生活史存在較大差異，但鑒于其基本生物學(xué)過程的相似性，哺乳動物和果蠅中可能會存在具有統(tǒng)一性的有效延長壽命的機(jī)制.因此，果蠅的壽命研究可能會對哺乳動物(包括人類)類似機(jī)制的分析提供有用性參考[4].果蠅一直是理想的節(jié)律、睡眠與壽命機(jī)制分析的動物模型，我們可以通過突變體果蠅了解時差反應(yīng)和果蠅體內(nèi)的時差蛋白對于壽命的影響，從而為針對性探究倒時差的環(huán)境對人體生理反應(yīng)的影響提供實驗和理論支持[5].

從藍(lán)細(xì)菌到人類的大部分生物體中，都發(fā)現(xiàn)具有約為24h周期性的內(nèi)生性晝夜節(jié)律鐘.生物體節(jié)律通常更接近LD周期(12h光照∶12h黑暗)，更接近它們的自然晝夜節(jié)律，這樣的內(nèi)生性晝夜節(jié)律鐘可能使內(nèi)部和外部節(jié)律之間的時差最小化[6].近年來，“時鐘基因”家族的克隆和特征研究，提高了我們對于果蠅及哺乳動物生物鐘分子機(jī)制的理解.其中，Cry蛋白(Cryptochrome是一種藍(lán)光感受器[7-9])通過Jet蛋白(Jetlag是一種F-box蛋白[3])和啟動分子時鐘重置的蛋白酶體，介導(dǎo)Tim蛋白(Timeless是一種光依賴時鐘蛋白[10-11])的快速光依賴性降解.當(dāng)果蠅暴露于光照條件下，體內(nèi)的Jet蛋白使其對光照敏感，從而對光照做出快速應(yīng)答.然而，Jet蛋白的功能性喪失使得果蠅對光照不敏感，不能夠?qū)庹兆鞒黾皶r的應(yīng)答，使得內(nèi)部和外部節(jié)律不協(xié)調(diào)，從而產(chǎn)生時差反應(yīng).果蠅的生物鐘對光照時間敏感，在大自然中，這種對光照作出快速應(yīng)答的方式，使得它們將內(nèi)置時鐘作為一個計時設(shè)備，生理活動可以與季節(jié)變化同步，也使得它們在跨時區(qū)的時候，能夠快速適應(yīng)新的時區(qū)[12].已知慢性時差會加速果蠅的一種特定形式的運(yùn)動老化(是一種年齡相關(guān)的運(yùn)動障礙)，并且這種效應(yīng)可以通過改善晝夜節(jié)律所同步的環(huán)境變化而得到緩解[2].這些研究結(jié)果可能會促進(jìn)治療時差反應(yīng)和睡眠障礙的發(fā)展，并且可以提高我們對時鐘基因的改變在睡眠和神經(jīng)精神障礙等方面所作出的遺傳貢獻(xiàn)的理解.

本研究率先利用jet基因突變體果蠅模型進(jìn)行睡眠與壽命監(jiān)測，從而探討jet基因和時差環(huán)境對果蠅壽命的影響，實驗結(jié)果提示了jet基因的缺失對于果蠅壽命可能產(chǎn)生部分影響，對于果蠅中的Jet蛋白在果蠅壽命影響中的作用具有提示性意義，其作用機(jī)制與生物學(xué)意義還有待進(jìn)一步研究.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中用到的果蠅有w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+ 3種基因型[3,13]，均來自本實驗室保種.實驗中用到的果蠅活動監(jiān)測系統(tǒng)(Drosophila Activity Monitoring System, DAMS)購于美國Trikinetics公司，普通體式顯微鏡購于意大利OPTIKA公司，果蠅時差反應(yīng)培養(yǎng)的光照裝置購于上海良亮燈飾電器有限公司，透明食物管購于生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 果蠅培養(yǎng)

果蠅在標(biāo)準(zhǔn)玉米麥芽糖糊精培養(yǎng)基上，12h光照∶12h黑暗(LD)環(huán)境下培養(yǎng)，其周期(T)為24h，光照周期為12h(即T=24h;LD 12h∶12h).所有果蠅都在明暗12h交替，溫度25℃的環(huán)境中培養(yǎng).實驗中所用到的果蠅都挑選羽化8h以內(nèi)的雄果蠅[14].

1.2.2 果蠅睡眠節(jié)律活動監(jiān)測實驗

挑選羽化8h以內(nèi)的雄性果蠅，單只放入65mm×5mm的特制果蠅管中，置于果蠅活動監(jiān)測系統(tǒng)(DAMS)中，每種基因型需平行測試15～30只.將環(huán)境參數(shù)設(shè)置為LD環(huán)境，早上9點(diǎn)燈亮，晚上9點(diǎn)燈滅，另一組環(huán)境參數(shù)設(shè)置為DD環(huán)境，持續(xù)黑暗.待果蠅適應(yīng)環(huán)境3～5d后開始正式測試，以1min/次的頻率記錄下果蠅的活動次數(shù).5～7d后結(jié)束監(jiān)測，收集整理實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[15].果蠅的睡眠與哺乳動物類似，大多是生活在12h明暗交替的環(huán)境中，利用DAMS系統(tǒng)進(jìn)行紅外線的檢測，基于果蠅每分鐘的活動次數(shù)，判斷及估算果蠅的睡眠時間，其測試值與實際值相比較，誤差在可接受范圍內(nèi)，由各因素導(dǎo)致的睡眠水平的不同可以區(qū)分顯著性.

在數(shù)據(jù)分析中，標(biāo)準(zhǔn)睡眠曲線圖通過統(tǒng)計果蠅每30min內(nèi)的平均睡眠時間繪制.果蠅睡眠時間及用于描述睡眠行為的參數(shù)計算使用R語言程序?qū)崿F(xiàn).正態(tài)分布的兩種基因型參數(shù)的顯著性差異比較采用student’st-test，多種基因型的比較則采用one-way ANOVA.兩種比較分別通過Sigma Plot、SPSS統(tǒng)計軟件實現(xiàn).

1.2.3 果蠅壽命監(jiān)測實驗

分別挑選羽化8h以內(nèi)的w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+ 3種基因型的雄果蠅，每種基因型的雄果蠅分別放入10個透明食物管中，每管10只果蠅.將3種基因型的果蠅各10管(共30管)，放入明暗12h交替，溫度25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此為一組.第1組果蠅在正常LD的光照周期下培養(yǎng)，為對照組；第2組果蠅每7d一次，調(diào)整其光照周期提前8h，其他條件與對照組一致，命名為提前組；第3組果蠅每7d一次，調(diào)整其光照周期延遲8h，其他條件與對照組一致，命名為延后組.實驗開始后，在每組果蠅的光照狀態(tài)下，每天記錄死亡果蠅的數(shù)量，每3d更換一次食物，直至每組果蠅全部死亡，實驗結(jié)束.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

獲得的數(shù)據(jù)通過Sigma Plot、Coreldraw、Lifespan等軟件分析并作圖.對于壽命檢測實驗，先進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)匯總，接著將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Lifespan程序包中，R語言環(huán)境為3.3.2，編程軟件為R Studio.根據(jù)所統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，進(jìn)行生存分析，繪制不同基因型及不同生存環(huán)境下的果蠅存活率數(shù)據(jù)圖.數(shù)據(jù)完全根據(jù)實驗方法所獲得，每組數(shù)據(jù)分析采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM).對于成正態(tài)分布的數(shù)據(jù)一般通過student’st-test和生存分析比較(多組).對壽命監(jiān)測實驗數(shù)據(jù)主要采用生存分析，分為兩組比較和兩組以上比較.當(dāng)*P<0.05，即為有顯著性差異，同時設(shè)定**P<0.01，***P<0.001.

2 結(jié) 果

2.1 w1118果蠅與yw;jetc;+、yw;jetr;+果蠅的標(biāo)準(zhǔn)睡眠曲線圖比較

由于Amita Sehgal等[3]關(guān)于jet基因型的研究工作中采用了w1118野生型果蠅為對照組，進(jìn)行節(jié)律分析，得出了jet突變體果蠅具有時差反應(yīng)這一結(jié)論.由此，為探尋jet基因型與野生型果蠅在時差反應(yīng)中對壽命的影響關(guān)系，我們也延續(xù)這一標(biāo)準(zhǔn)，采用w1118基因型的果蠅進(jìn)行睡眠以及壽命實驗.首先，為排除w1118與yw品系的果蠅遺傳背景的影響，比較分析并統(tǒng)計兩種基因型的果蠅每30min的睡眠時間以及白天睡眠總量、夜間睡眠總量、全天睡眠總量等，做出睡眠曲線圖與睡眠柱狀圖(圖1).

圖1 w1118與yw的睡眠差異比較Fig.1 The comparison of w1118 and yw in sleep difference(a) w1118與yw的睡眠趨勢圖，每個點(diǎn)表示果蠅30min睡眠總量平均值，測試中果蠅處于LD環(huán)境.(b) w1118與yw白天、夜間及全天睡眠總量柱狀圖，均值比較采用one-way ANOVA檢驗(n.s.: 無顯著性差異).

比較得出，w1118與yw品系的果蠅在睡眠節(jié)律與睡眠量等方面并無顯著性差異(n.s.)，由此，我們可以排除兩者之間的遺傳背景不同可能會給實驗結(jié)果帶來的影響，可以進(jìn)一步利用兩種jet突變體果蠅，與對照組果蠅的睡眠狀況進(jìn)行比較分析.

實驗中將w1118作為對照組，yw;jetc;+、yw;jetr;+作為實驗組，進(jìn)行睡眠監(jiān)測，收集整理實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖，實驗結(jié)果如圖2，圖3所示.我們分別統(tǒng)計了3種基因型果蠅每30min的睡眠時間、白天睡眠總量、夜間睡眠總量、全天睡眠總量、全天睡眠次數(shù)和每段全天睡眠平均持續(xù)時間等睡眠參數(shù)來定量描述果蠅的睡眠狀況.

圖2 LD條件下，對照組和實驗組睡眠趨勢圖Fig.2 Sleep trends in control and experimental groups under LD condition每個點(diǎn)表示果蠅30min睡眠總量平均值，測試中果蠅處于LD環(huán)境.

圖3 LD條件下，對照組和實驗組白天、夜間及全天 睡眠總量柱狀圖Fig.3 Bar graph of day-time, night-time, and total in control and experimental groups under LD condition均值比較采用one-way ANOVA檢驗，**P<0.01,***P<0.001.

由睡眠曲線可以看出，實驗組的曲線位于對照組上方.分析指出，相比于對照組(w1118)，實驗組的果蠅(yw;jetc;+，yw;jetr;+)白天和夜間的睡眠時間均顯著性增加，其中對照組白天和夜間睡眠分別為(247.9310±3.1435)min和(356.1494±3.5507)min,而實驗組與之相對應(yīng)的值分別有(296.0000±4.3549)min和(528.0000±3.8087)min(yw;jetc;+)，(447.3846±2.9812)min和(432.3077±3.6210)min(yw;jetr;+).

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，我們可以得出，兩種jet突變體果蠅在一天中的睡眠總量均顯著高于野生型果蠅，進(jìn)而推測果蠅神經(jīng)元內(nèi)Jet蛋白功能的喪失會導(dǎo)致睡眠總量的升高，提示Jet蛋白本身可能在果蠅睡眠調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，生物鐘環(huán)路的變化也可能與睡眠時間的延長存在相關(guān)性.

2.2 w1118果蠅與yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅的睡眠參數(shù)統(tǒng)計分析

圖4 LD條件下對照組和實驗組平均 每分鐘活動量柱狀圖Fig.4 Bar graph of the average activity per minute in the control and experimental groups under LD condition均值比較采用one-way ANOVA檢驗，n.s.： 無顯著性差異.

對w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+基因型雄果蠅的標(biāo)準(zhǔn)睡眠數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計3種基因型果蠅的全天睡眠總量及睡眠次數(shù)，并得出平均睡眠時間，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.為了排除對照組果蠅與實驗組果蠅自身活動性差異可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，我們檢測了yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅活動性與w1118果蠅是否一致.采用平均每分鐘的活動量為參數(shù)進(jìn)行比較，如圖4所示.

由圖4可知，yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅與w1118果蠅的平均每分鐘活動量并無顯著性差異，yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅的活動性表現(xiàn)正常，并未對睡眠量的升高造成顯著影響，同時，也驗證了Amita Sehgal等關(guān)于jet基因型的研究工作中的結(jié)論，jet突變體果蠅在LD條件下的活動性保持正常.因此，我們可以排除對照組果蠅與實驗組果蠅自身活動性差異可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響.

對于實驗組與對照組的睡眠量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，yw;jetc;+基因型果蠅的全天睡眠時間總量顯著高于w1118果蠅(**P<0.01)，且平均睡眠時間顯著高于w1118果蠅(***P<0.001)，從而，全天睡眠次數(shù)顯著低于w1118果蠅(***P<0.001)(圖5(a)).進(jìn)一步分析全天睡眠參數(shù)顯示，yw;jetr;+果蠅全天睡眠次數(shù)并沒有發(fā)生明顯的變化，而平均每段睡眠的持續(xù)時間卻從平均(37.0349±1.4653)min/次提高到(48.6631±2.0521)min/次，且在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異.yw;jetc;+果蠅全天睡眠次數(shù)顯著降低，由平均(21.1609±0.8903)次降低到(13.5667±0.9455)次，而平均每段睡眠的持續(xù)時間卻從平均(37.0349±1.4653)min/次提高到(76.2802±3.0607)min/次，且具有顯著性差異(圖5(b)).這也就意味著，兩種同類型jet突變體果蠅的睡眠總量的提升是由促進(jìn)了睡眠狀態(tài)的維持所引起的.

圖6 DD條件下，對照組和實驗組睡眠趨勢圖Fig.6 Sleep trends in control and experimental groups under DD condition

以上數(shù)據(jù)說明，在LD條件下，兩種同類型jet突變體果蠅的睡眠時間顯著高于對照組果蠅，其睡眠次數(shù)相對較少，每次睡眠持續(xù)時間較長.果蠅體內(nèi)Jet蛋白的缺失可能會促進(jìn)睡眠質(zhì)量的提升，提示了Jet蛋白功能的缺失反而能促進(jìn)果蠅睡眠的維持，出現(xiàn)嗜睡癥狀(嗜睡是果蠅中一種以睡眠量過量為特征的現(xiàn)象，其以白天睡眠量顯著升高為主要特征).

為了進(jìn)一步探究jet基因的缺失是否會對DD(Dark Dark)條件下突變體果蠅的睡眠有類似的影響，我們對置于DD條件下的w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+基因型的雄果蠅的標(biāo)準(zhǔn)睡眠數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示.

對于DD條件下，實驗組果蠅和對照組果蠅的睡眠狀態(tài)，我們選用與LD條件下相同的參數(shù)進(jìn)行比較分析，由睡眠曲線(圖7)可以看出，實驗組的曲線位于對照組上方.相比于對照組(w1118)，實驗組的果蠅(yw;jetc;+，yw;jetr;+)白天和夜間的睡眠時間均顯著性增加，其中對照組白天和夜間睡眠分別為(162.8333±3.8602) min和(251.5000±3.7976) min,而實驗組與之相對應(yīng)的值分別有(205.6061±4.1871) min和(499.2424±3.5707) min(yw;jetc;+)，(384.6667±4.4799) min和(497.8333±3.9815) min(yw;jetr;+).

同樣的，為了排除對照組果蠅與實驗組果蠅自身活動性差異可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，我們檢測了在DD條件下yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅活動性與w1118果蠅是否一致.采用平均每分鐘的活動量為參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖8所示.

圖7 DD條件下，對照組和實驗組白天、夜間及全天睡眠總量柱狀圖Fig.7 Bar graph of day-time, night-time, and total in control and experimental groups under DD condition均值比較采用one-way ANOVA檢驗，***P<0.001.

圖8 DD條件下對照組和實驗組平均每分鐘 活動量柱狀圖Fig.8 Bar graph of the average activity per minute in the control and experimental groups under DD condition均值比較采用one-way ANOVA檢驗，n.s.： 無顯著性差異.

在DD條件下，yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅與w1118果蠅的平均每分鐘活動量并無顯著性差異，突變體果蠅的活動性與對照組活動性一致，yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅的活動性表現(xiàn)正常，并未對睡眠量的升高造成顯著影響.

對于實驗組與對照組的睡眠量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，與LD條件下表現(xiàn)相同的是，yw;jetc;+與yw;jetr;+基因型果蠅的全天睡眠時間總量均顯著高于w1118果蠅(***P<0.001)，且平均睡眠時間顯著高于w1118果蠅(***P<0.001).全天睡眠參數(shù)(圖9)顯示，與w1118相比，yw;jetc;+與yw;jetr;+果蠅全天睡眠次數(shù)顯著降低，由平均(37.0333±1.1304)次降低到(20.3333±1.1072)次和(26.4667±1.3661)次，而平均每段睡眠的持續(xù)時間卻從平均(11.2479±0.8173) min/次提高到(39.2554±1.6289) min/次和(46.7309±3.0450) min/次，且具有顯著性差異.數(shù)據(jù)表明，在DD條件下，突變體果蠅睡眠的異常與LD條件下基本保持一致.

圖9 DD條件下全天睡眠次數(shù)與平均睡眠時間柱狀圖Fig.9 Bar graph of sleep bout number and sleep bout duration under DD condition(a) 對照組與實驗組的全天睡眠次數(shù)；(b) 對照組與實驗組的全天睡眠平均時間.均值比較采用one-way ANOVA檢驗，***P<0.001.

通過DD條件下兩種突變體果蠅睡眠量和睡眠狀態(tài)的分析，我們進(jìn)一步驗證了LD條件下的推測，果蠅體內(nèi)Jet蛋白的缺失可能會促進(jìn)睡眠量的增加，jet基因的缺失使得果蠅的睡眠量出現(xiàn)異常，出現(xiàn)嗜睡癥狀.

2.3 jet突變體果蠅的壽命曲線

圖10 正常光照下對照組與實驗組的壽命曲線圖Fig.10 Life curve of the control group and the experimental groups under normal light cycle conditions在正常12h∶12h光照周期情況下，野生型果蠅生存狀況良好，呈現(xiàn)良好的壽命分布，突變體果蠅yw;jetc;+，ywjetr;+與正常果蠅的存活率呈現(xiàn)顯著性差異(yw;jetc;+和w1118： ***P<0.001; ywjetr;+和w1118： ***P<0.001).

為了探究Jet蛋白的功能性喪失對于果蠅壽命的影響，我們首先進(jìn)行了正常環(huán)境條件下的果蠅壽命監(jiān)測.分別統(tǒng)計w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+基因型的雄果蠅在正常LD光照周期下的壽命，將壽命數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言程序包，利用Lifespan程序[16]作出存活率曲線圖，每種基因型的果蠅約100只.

從圖10可以看出，對照組和實驗組在前45d左右的存活率基本保持一致，在壽命的后程階段，3種基因型的果蠅呈現(xiàn)不同的趨向.w1118果蠅存活率下降趨勢較為平緩，基本保持平穩(wěn)下降，yw;jetc;+果蠅的存活率在83d左右呈現(xiàn)斷崖式下降，總體存活率高于對照組果蠅，yw;jetr;+果蠅呈現(xiàn)出較為迅速的下降趨勢.對照組和實驗組果蠅壽命趨勢可以明顯區(qū)分和比較.

2.4 不同的時差條件對jet突變體果蠅壽命的影響

圖11 (a) w1118、(b) yw;jetc;+和(c) ywjetr;+ 在3種光照周期條件下的壽命曲線圖Fig.11 Life curve of w1118(a) , yw;jetc;+(b) and yw;jetr;+(c) under three light cycles(a)w1118基因型的果蠅正常情況下與提前組和延后組的存活率并無太大差異. (b), (c)相較于對照組，提前組和延后組的生存狀況良好.

為了解在不同時差環(huán)境中，Jet蛋白的功能性喪失對果蠅的壽命有何影響，我們進(jìn)行了正常果蠅與突變體果蠅在不同的時差條件下的壽命比較.分別統(tǒng)計了w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+基因型的雄果蠅在提前組和延后組(見材料與方法)情況下的壽命，與正常環(huán)境周期下的果蠅進(jìn)行自身對照.對w1118基因型的果蠅在正常條件下以及提前組和延后組條件下的存活率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖.根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，對照組果蠅的壽命為(67.7692±1.8634) d，提前組果蠅為(65.2874±2.1301) d，延后組果蠅為(70.3333±1.4514) d.從圖11(a)中可以看出，相對于對照組果蠅，每隔7d將光照周期提前8h所產(chǎn)生的時差，使得本身不具有時差反應(yīng)的野生型果蠅在壽命上并無太大改變(n.s.)，而延后組的果蠅壽命有輕微的延長(*P<0.05).在正常光照時間周期持續(xù)到第50天時，對照組果蠅有75只存活，光照周期每周提前的果蠅有72只存活，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅有80只存活，在當(dāng)存活率到達(dá)50%時，對照組果蠅的壽命已經(jīng)到達(dá)69d，光照周期每周提前的果蠅壽命達(dá)到68d，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅壽命為72d.在野生型果蠅體內(nèi)，其正常功能的實現(xiàn)需要依靠各種時鐘蛋白的相互調(diào)控.在很大程度上，整個節(jié)律系統(tǒng)必須依靠外部及內(nèi)部分子的變化來維持正常的內(nèi)生性生物鐘的調(diào)控.它們通過協(xié)調(diào)多種組織和細(xì)胞分子的活動，不斷地進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而維持其日常的生理和行為活動.這種內(nèi)源性節(jié)律調(diào)控對光線急劇或輕微變化(如閃電和滿月)而言相對難以適應(yīng)，但對黎明和黃昏以及適應(yīng)季節(jié)變化導(dǎo)致的日長時間變化非常敏感[17].w1118果蠅本身有完整的時鐘蛋白調(diào)控系統(tǒng)，能夠通過調(diào)節(jié)Jet蛋白與Cry蛋白的結(jié)合，引起Tim蛋白的下調(diào)，來對光照條件的變化進(jìn)行快速應(yīng)答，進(jìn)而維持整個生命周期的調(diào)控[18].

基因型為yw;jetc;+的果蠅在提前組和延后組的光照條件中，受光照周期變化的影響，其生存狀況良好，在果蠅壽命的后程，其存活率顯著高于對照組.由圖11(b)可知，在正常光照時間周期持續(xù)到第50天時，對照組果蠅有71只存活，光照周期每周提前的果蠅依然有81只存活，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅有79只存活，在當(dāng)存活率到達(dá)50%時，對照組果蠅的壽命為83d，光照周期每周提前的果蠅壽命達(dá)到89d，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅壽命為86d.根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，對照組果蠅的壽命為(71.6296±2.7848) d，提前組果蠅為(80.7416±2.5626) d，延后組果蠅為(73.1684±3.0426) d.對于yw;jetc;+基因型的突變體果蠅，逐步推進(jìn)或延后其光照周期，延長了該突變體果蠅的壽命，即時差條件可能會有利于其生存，給予其一定的時差環(huán)境可能會對其自身的壽命調(diào)控機(jī)制起到一定的正向作用.

基因型為yw;jetr;+的果蠅在提前組和延后組的光照條件中，也顯示了同樣的趨勢(圖11(c)).根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，對照組果蠅壽命為(62.1529±1.5556) d，提前組為(65.9111±2.6990) d，延后組為(71.8421±2.3074) d.在正常光照時間周期持續(xù)到第50天時，對照組果蠅有67只存活，光照周期每周提前的果蠅有73只存活，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅有80只存活，在當(dāng)存活率到達(dá)50%時，對照果蠅的壽命已經(jīng)到達(dá)64d，光照周期每周提前的果蠅壽命達(dá)到76d，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅壽命為82d.同樣地，我們可以得出與yw;jetc;+果蠅類似的推論，對于yw;jetr;+果蠅來說，逐步推進(jìn)或延后其光照周期，延長了該突變體果蠅的壽命，即時差條件可能會有利于其生存.

表1總結(jié)了3種基因型的果蠅在不同的環(huán)境條件下的兩個生存標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)： 果蠅達(dá)到50%存活率的天數(shù)以及在第50天果蠅的存活率.在9組實驗下，分別對3個實驗環(huán)境中的每個實驗環(huán)境中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析.

表1 對照組和實驗組在不同的條件下的兩個生存標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)

注：Nx表示每組果蠅的數(shù)量，N1=91,N2=87,N3=87,N4=95,N5=89,N6=95,N7=85,N8=90,N9=95.

注： -表示無顯著性差異比較，n.s.表示不存在顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(生存分析比較).

表2總結(jié)了對照組和實驗組在3種時差條件下的顯著性差異比較.在比較分析中，我們提出兩個問題： 兩種基因型的果蠅在不同的時差環(huán)境中的生存能力是否有顯著差異；jet突變體果蠅在不同的時差條件下的平均生存率是否顯著大于正常環(huán)境下的平均值？結(jié)果表明： 在突變體果蠅的生存實驗中，無論是50%存活率的天數(shù)標(biāo)準(zhǔn)還是在第50天存活的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)，都表現(xiàn)出了在時差環(huán)境下，其壽命的延長.僅考慮這3種周期性時差的環(huán)境，清楚地表明了一點(diǎn)，對于jet突變體果蠅來說，給予相應(yīng)的時差環(huán)境，有利于其壽命的延長.而對于野生型果蠅w1118來說，每隔7d將生物鐘提前8h并沒有對其生長造成顯著影響，然而每隔7d將生物鐘延后8h的情況對其壽命有輕微影響，總體來說，并沒有太大差異.已有研究表明，在光照情況下，野生型果蠅對光照反應(yīng)敏感，內(nèi)置生物周期可以對光照周期的改變作出快速應(yīng)答，調(diào)控Tim蛋白的降解，進(jìn)而調(diào)控整個節(jié)律系統(tǒng)[3].由此我們可以推測，正是這種對光反應(yīng)的快速應(yīng)答，使得光照周期的改變并不能對其產(chǎn)生明顯影響，可能對壽命的影響也微乎其微.

3 討 論

在果蠅的睡眠監(jiān)測實驗中，我們可以發(fā)現(xiàn)，兩種同類型jet突變體果蠅的睡眠時間顯著高于對照組果蠅，其睡眠次數(shù)相對較少，每次睡眠時間較長，這種表現(xiàn)的異常也就提示了Jet蛋白功能的缺失反而能促進(jìn)果蠅睡眠的維持，出現(xiàn)嗜睡癥狀.在3組壽命監(jiān)測實驗中，兩種jet突變體壽命在時差環(huán)境中表現(xiàn)出顯著性延長，而對照組果蠅則沒有明顯變化.由突變體基因型和對照組基因型的睡眠及壽命比較可知，兩種同類型jet突變體的睡眠量的增加對于正常條件下壽命的影響可能不具有相關(guān)性.

本次實驗結(jié)果首次展示，對于jet突變體果蠅，在時差條件下，Jet蛋白功能的缺失可能有利于其壽命的延長，起到正向的環(huán)境誘導(dǎo)作用.根據(jù)實驗結(jié)果推測，野生型果蠅本身表達(dá)Jet蛋白，并且可以及時對光照作出應(yīng)答，然而利用轉(zhuǎn)基因手段，使得遺傳學(xué)上保守的jet基因不能正常表達(dá)，類似于給予果蠅人為的不利條件，將其置于時差環(huán)境中，可能會起到類似挽救的作用，從而在宏觀上表現(xiàn)出壽命的顯著性延長，而對于野生型果蠅則沒有類似的作用.一般認(rèn)為，睡眠量減少與壽命降低有顯著性關(guān)聯(lián)，但是鮮有睡眠量的增加與壽命的延長有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的研究.分析認(rèn)為，w1118果蠅的睡眠量保持正常狀態(tài)，具有正常的生物鐘環(huán)路，而影響野生型果蠅壽命的方式和途徑有多種，其中，比較常見的有JNK、MAPK、mTOR、Wnt、Notch和Hippo信號傳導(dǎo)途徑等，涉及到自噬、翻譯、糖酵解、氧化磷酸化、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、神經(jīng)發(fā)生、睡眠和對DNA損傷的反應(yīng)等[19-20].本文的實驗探究中，以野生型果蠅作為對照，利用突變體果蠅尋找內(nèi)部節(jié)律與外部環(huán)境中的關(guān)聯(lián)，果蠅睡眠量的變化可能受多種途徑和方式的共同影響，使得果蠅壽命作出一定的改變，其中的影響途徑較為復(fù)雜，并未表現(xiàn)出一致性.所以，我們在探究兩者之間聯(lián)系的可能性的同時，不否認(rèn)其過程中其他內(nèi)置因素對于結(jié)果的影響，由此表現(xiàn)出壽命與睡眠長度未完全一致.

已知果蠅節(jié)律研究中，Tim蛋白對光敏感，即使是短暫的光脈沖也會觸發(fā)Tim蛋白的降解，體內(nèi)Tim蛋白水平的變化可以重置分子時鐘，并引起生物鐘的重置[21-22].進(jìn)一步研究指出，Jet與Cry相互作用在果蠅體內(nèi)非常重要，能夠保障高效的光誘導(dǎo)的Tim降解[21].一般有兩種方式： Cry與Tim的結(jié)合可以修飾Tim，使它可以結(jié)合Jet誘導(dǎo)降解；另一種是Jet-Cry復(fù)合物與Tim結(jié)合，從而誘導(dǎo)Tim降解，因此Jet-Cry復(fù)合物對于Tim的修飾是引起Tim蛋白快速光依賴性降解的重要部分[3,23].已知不同的基因操作和環(huán)境干預(yù)可延長果蠅的壽命[4]，環(huán)境因素會對jet時鐘基因影響其壽命產(chǎn)生一定作用，并且功能性的生物鐘改變能防止果蠅過早老化，由此，jet突變體果蠅由于特定的遺傳和/或環(huán)境因素而顯示出復(fù)雜的壽命變異性模式[24].果蠅的廣義抗逆性可能是在整個物種中延長成年壽命的主要機(jī)制，其抗性機(jī)制在不同的基因型中表達(dá)延長的壽命表型可能會涉及不同的遺傳、分子和生理機(jī)制[5].一方面，在jet突變體果蠅中，Jet蛋白功能的喪失引起了Tim蛋白的不充分降解，其內(nèi)置周期性調(diào)節(jié)不完全，可能會引起自身調(diào)節(jié)機(jī)制的損害，而在外部施加時差環(huán)境之后，可能會使得環(huán)境條件接近其內(nèi)生環(huán)境，表現(xiàn)出壽命的延長[24-25].另一方面，F(xiàn)-box蛋白Jetlag參與了生物鐘的重置機(jī)制，普遍認(rèn)為，Jet是Skp1/Cullin/F-Box(SCF)E3泛素連接酶復(fù)合物組分，其在Cry存在的情況下與Tim以光依賴的方式結(jié)合.這種相互作用促進(jìn)Tim的泛素化和降解，而突變體果蠅在Tim的泛素化方面效果較差[10].SCF復(fù)合物調(diào)節(jié)許多不同的細(xì)胞和發(fā)育過程,Jet與SkpA(果蠅中的幾種Skp1同源物之一)相互作用.skpA是表達(dá)最豐富的果蠅skp1相關(guān)基因，果蠅SkpA是SCF泛素連接酶的一個組成部分，它調(diào)節(jié)細(xì)胞和中心體周期之間的聯(lián)系.SkpA在調(diào)節(jié)中心體復(fù)制，核內(nèi)復(fù)制，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞周期蛋白E積累等方面發(fā)揮重要作用[26].而在突變體果蠅中，Jet蛋白含量的變化使得其不可避免地對與SkpA的相互作用產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而通過SCF復(fù)合物造成對整個生命周期的影響.同時，jet基因?qū)λダ?、心律失常等都有一定的影響，我們推測jet的缺失可能不是主要通過對下游基因tim的表達(dá)調(diào)控引起睡眠異常，而是通過多種途徑對生物周期產(chǎn)生影響.

在哺乳動物中，我們會經(jīng)常認(rèn)為時差反應(yīng)會帶來健康的危害以及壽命的減短，本文利用jet突變體果蠅首次發(fā)現(xiàn)時差環(huán)境下，可能會有利于該時差蛋白缺失果蠅壽命的延長.我們推測，野生型果蠅自身合成Jet蛋白，可及時對光照作出應(yīng)答，利用轉(zhuǎn)基因手段，使得其體內(nèi)本應(yīng)正常表達(dá)的jet基因不能參與正常的時差蛋白調(diào)控后，可以認(rèn)為是人為的給予果蠅以時差蛋白的缺失，其內(nèi)部穩(wěn)態(tài)環(huán)境受到破壞，當(dāng)在外部環(huán)境中給予一定時差后，影響了相關(guān)時差蛋白的調(diào)控，從而影響相關(guān)激素水平及蛋白水平的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響到壽命的調(diào)控.而對于野生型果蠅，其本身內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，給予時差環(huán)境后，對其內(nèi)部穩(wěn)態(tài)并無明顯改變，由此并沒有表現(xiàn)出明顯的作用.我們認(rèn)為，進(jìn)一步探究jet突變體果蠅壽命延長現(xiàn)象的原因可能的方向是，在jet突變體果蠅中，Jet蛋白的缺失引起了Tim蛋白的不充分降解，其內(nèi)置周期性調(diào)節(jié)不完全，引起內(nèi)置環(huán)境的損害，而在外部施加時差環(huán)境之后，維持在環(huán)境條件接近其內(nèi)生環(huán)境中，表現(xiàn)出壽命的延長，另一種可能的方向是Jet蛋白含量的變化使得其對與SkpA的相互作用產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而通過SCF復(fù)合物造成對整個生命周期的影響.這些結(jié)果提示，今后可以利用果蠅的jet突變體模型，深入研究時差蛋白對果蠅內(nèi)部節(jié)律及激素水平調(diào)節(jié)的神經(jīng)環(huán)路和細(xì)胞分子基礎(chǔ).

時差環(huán)境是如何對生物產(chǎn)生影響的？在生物界中，科學(xué)的闡述生物體內(nèi)如何對快速的光周期的變化作出應(yīng)答是十分必要的.在果蠅中存在的與時差反應(yīng)有重要聯(lián)系的Jet蛋白，以及與它具有高度相似性的哺乳動物F-box蛋白的功能尚未有清晰的確定.我們未來的工作將進(jìn)一步研究控制Jet蛋白水平變化的條件因素和分子機(jī)制，進(jìn)而觀察在果蠅體內(nèi)，時鐘蛋白水平的變化對果蠅內(nèi)環(huán)境所產(chǎn)生的多方面影響，后續(xù)可以探究時差環(huán)境使得jet突變體果蠅壽命延長的分子機(jī)制，從而對人類的壽命研究有所提示.