劉延群 賈立濤 劉春燕 陳潔 周廣東

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是臨床常見疾病[1]，病因復(fù)雜，目前尚缺乏有效的治療方法。OA與多種危險(xiǎn)因素有關(guān)，包括遺傳因素、組成因素以及促成OA發(fā)展的若干化學(xué)和生物力學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因素，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的合成和降解之間的不平衡。大量證據(jù)表明，OA是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，其特征是軟骨細(xì)胞死亡，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）損失[2]，這亦是OA發(fā)生發(fā)展的主要原因[1-3]。

研究表明，JNK抑制劑可以有效減少危險(xiǎn)因素對(duì)OA細(xì)胞外基質(zhì)的破壞。JNK與ERK途徑激活c-Jun，通過調(diào)節(jié)促炎癥細(xì)胞因子（如TNFα和IL）的表達(dá)，導(dǎo)致蛋白多糖合成減少和軟骨降解酶MMP-13的產(chǎn)生增加[4-6]。抑制JNK途徑可能是預(yù)防和治療OA的方式之一[7]。本課題擬通過研究JNK抑制劑（SP600125）對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響，為JNK抑制劑在OA治療中的應(yīng)用提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)液（Gibco公司，美國(guó)）、0.05%胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)）、0.25%Ⅱ型膠原酶、鏈霉素、青霉素（Gibco公司，美國(guó)），胎牛血清（HYCLONE公司，美國(guó)），CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)，日本），無紡聚乙醇酸（PGA）纖維（組織工程國(guó)家工程研究中心提供），SP600125（ADOOQ 公司，美國(guó)），SEM（Philips XL-30， 荷蘭）， 連續(xù)熒光檢測(cè)器（Stratagene MX3000P，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡新西蘭白兔1只 （上海甲干生物科技有限公司）。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則。

1.3 獲取兔耳軟骨細(xì)胞

取兔耳軟骨，將軟骨片切碎成1.0 mm3大小，置于DMEM中，0.25%Ⅱ型膠原酶37℃消化8 h。然后將收獲的軟骨細(xì)胞接種到含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)皿（10cm）中，37℃、5%CO2下培養(yǎng)。取第2代軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液：含有10%FBS、1%青霉素、鏈霉素和 JNK 抑制劑（SP600125，濃度 100 nmol/mL）的DMEM培養(yǎng)液；對(duì)照組培養(yǎng)液：含有10%FBS和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。

1.5 支架材料的制備

取適量的PLA粉末，用二氯甲烷配制成濃度為0.5%的溶液。稱取15 mg PGA纖維放進(jìn)針筒內(nèi)，分次滴加少許0.5%PLA溶液，將PGA/PLA聚合物壓成直徑9 mm、厚2 mm的柱狀細(xì)胞支架，掃描電鏡下拍照，75%乙醇消毒后備用。

1.6 細(xì)胞－支架復(fù)合物的制備

調(diào)整第2代軟骨細(xì)胞密度為8×107cells/mL，將細(xì)胞懸液均勻地滴加在已消毒的PGA/PLA材料上，37℃、5%濃度CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng)，4 h后樣本隨機(jī)分組，對(duì)照組加普通血清培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組添加SP600125工作液；兩組細(xì)胞-支架復(fù)合物均在37℃、95%濕度和5%CO2下培養(yǎng)8周。

1.7 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖情況

將第2代軟骨細(xì)胞（P2）以2 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，加入100 μL PBS以防止水分丟失。實(shí)驗(yàn)組各孔加入100 μL SP600125工作液，對(duì)照組各孔加入100 μL普通培養(yǎng)液。兩組均常規(guī)培養(yǎng)，隔天全量更換相應(yīng)培養(yǎng)液。體外培養(yǎng)11 d，從第1天開始，隔天每組取5個(gè)孔加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育120 min，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組均設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔（單純培養(yǎng)基，沒有細(xì)胞），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.8 RT-PCR

體外培養(yǎng)8周后，每組分別提取組織樣品的總RNA，通過反向聚合酶轉(zhuǎn)錄（RT）獲得cDNA。用連續(xù)熒光檢測(cè)器進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)軟骨特異性基因 IGF、COLⅡ、COLⅨ、TGF－β1 的表達(dá)情況。 將 βactin mRNA設(shè)為內(nèi)參（表1）。

1.9 組織學(xué)觀察

將體外培養(yǎng)8周后的細(xì)胞-支架復(fù)合物在多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋，5μm切片，行HE染色與Safranin-O染色。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism軟件（Version 5.0，美國(guó)）行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP600125對(duì)體外軟骨細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞的增殖明顯快于對(duì)照組（圖1）。

2.2 細(xì)胞-支架復(fù)合物的構(gòu)建

PGA/PLA支架形狀規(guī)整，表面粗糙；掃描電鏡顯示，PGA/PLA支架的孔徑多大于100 μm；細(xì)胞-支架復(fù)合物中細(xì)胞在支架表面分布均勻，呈淡黃色（圖 2）。

2.3 RT-PCR檢測(cè)軟骨相關(guān)特異性基因的表達(dá)

細(xì)胞－支架復(fù)合物體外培養(yǎng)8周后，RT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組 IGF、COLⅡ、COLⅨ、TGFβ1 的表達(dá)均顯著下降，與對(duì)照組差異明顯（P＜0.01）（圖 3）。

2.4 組織學(xué)觀察

HE染色顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)體外培養(yǎng)8周后，再生軟骨質(zhì)量顯著下降，軟骨厚度降低，軟骨陷窩的成熟度較差；Safranin-O染色結(jié)果顯示，相較與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成量顯著降低（圖 4）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 各組細(xì)胞增殖曲線Fig.1 Cell proliferation curve of each group

圖2 細(xì)胞-支架復(fù)合物的構(gòu)建Fig.2 The construction of cell-scaffold complex

圖3 RT-PCR檢測(cè)各組軟骨特異性基因的表達(dá)（**：P＜0.01）Fig.3 Cartilage specific gene expression of each group detected by RT-PCR(**:P＜0.01)

圖4 各組組織學(xué)觀察Fig.4 Histological observation of each group

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為病理性特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病。關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細(xì)胞分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)形成的，軟骨細(xì)胞是維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成和更新的關(guān)鍵，軟骨細(xì)胞的逐漸喪失和細(xì)胞外基質(zhì)的降解被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的主要原因[8-9]。其中，TNF-α、白細(xì)胞介素等炎癥因子，在OA的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)可能是治療OA的有效途徑。

研究表明，JNK途徑通過激活下游因子c-Jun而促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，如TNFα、IL-6、IL-1等，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖合成減少和軟骨降解酶MMP-13的產(chǎn)生增加。因此，JNK途徑抑制劑被認(rèn)為可能是一種治療骨關(guān)節(jié)炎的有效途徑[7，10]。JNK信號(hào)通路是一種重要的蛋白激酶，在細(xì)胞的增殖、分化、存活以及凋亡中扮演重要的角色。然而，JNK通路抑制在不同組織、不同細(xì)胞、不同病理環(huán)境下，其作用不盡相同。研究顯示，JNK通路抑制劑SP600125對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖有抑制作用。Che等[11]的研究表明，在食管鱗癌細(xì)胞中可通過激活JNK通路而發(fā)揮其抗腫瘤作用。另有研究表明，抑制JNK通路的表達(dá)可用來促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡的發(fā)生，最終緩解肝纖維化的程度[12]。目前，JNK通路抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖作用仍未明確。本研究通過CCK-8檢測(cè)證實(shí)，JNK通路抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞具有顯著的促增殖作用。

抑制骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞的減少是延緩甚至阻斷骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，促進(jìn)軟骨外細(xì)胞基質(zhì)的合成則是修復(fù)關(guān)節(jié)損傷的重要環(huán)節(jié)。本研究進(jìn)一步對(duì)JNK通路抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響進(jìn)行了初步探討。RT-PCR證實(shí)了SP600125長(zhǎng)期使用可以顯著抑制包括 IGF、COLⅡ、COLⅨ、TGFβ1等在內(nèi)的軟骨特異性基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)顯著降低，并沒有形成成熟的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明，長(zhǎng)期獨(dú)立使用JNK抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成有抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示JNK通路抑制劑短期應(yīng)用對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用；JNK通路抑制劑長(zhǎng)期單獨(dú)應(yīng)用對(duì)軟骨細(xì)胞合成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)具有抑制作用。雖然JNK通路抑制劑短期應(yīng)用對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，但長(zhǎng)期應(yīng)用可抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成。因此，如何長(zhǎng)期安全地應(yīng)用JNK抑制劑治療OA是今后研究的重要方向。