郝文來(lái)　宋毅

摘要：目的：探究支鏈氨基酸作為糖尿病的生物標(biāo)志物，分析血漿氨基酸水平在糖尿病患者中的變化及聯(lián)系。方法：選取某院2017年3月-2018年12月收納的2型糖尿病患者54例作為研究對(duì)象，按照糖化血紅蛋白將其分為異常組25例（HbAlc>6.5%），29例正常組（HbAlc<=6.5%），選取于我院的同期體檢的25例正常人組。對(duì)三組受檢人群進(jìn)行血漿檢測(cè)，觀察體內(nèi)氨基酸水平改變。結(jié)果：異常組和正常組在成酮氨基酸（賴氨酸和亮氨酸）以及支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸）水平均較健康人組顯著更高（P<0.05），同時(shí)正常組水平升高幅度低于異常組（P<0.05）;異常組和正常組在成糖氨基酸（絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及蘇氨酸）水平和健康人組顯著減少（P<0.05），而異常組減少水平比異常組更顯著（P<0.05）。結(jié)論：針對(duì)2型糖尿病患者的疾病和代謝狀態(tài)通過(guò)檢驗(yàn)支鏈氨基酸等血漿氨氨基酸水平可反映出二者之間存在一定聯(lián)系，有利于糖尿病患者早期的診斷。

關(guān)鍵詞：支鏈氨基酸;糖尿病;生物標(biāo)志物

近些年來(lái)，人們經(jīng)濟(jì)條件、生活水平以及飲食結(jié)構(gòu)等不斷發(fā)生變化，糖尿病在國(guó)內(nèi)乃至世界范圍內(nèi)的患病人數(shù)處于逐年上升的趨勢(shì)，而糖尿病的相關(guān)臨床研究也成為熱點(diǎn)之一，受到了較大的社會(huì)關(guān)注。糖尿病國(guó)際聯(lián)盟數(shù)據(jù)表明，世界范圍內(nèi)糖尿病患病人數(shù)2013年統(tǒng)計(jì)為3.81億，保守預(yù)計(jì)糖尿病患者在2035年將超過(guò)5.5億。因我國(guó)人口眾多等因素，糖尿病患者人數(shù)長(zhǎng)期處于世界首位。同時(shí)，隨著科研者對(duì)于血漿水平內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的認(rèn)知不斷提高，研究發(fā)現(xiàn)，支鏈氨基酸（BCAAs）水平和2型糖尿病存在一定聯(lián)系。作為人體必需的氨基酸之一，支鏈氨基酸被制成營(yíng)養(yǎng)劑在臨床中廣泛應(yīng)用。支鏈氨基酸的研究較早，于上世紀(jì)五六十年代，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)血清中支鏈氨基酸出現(xiàn)水平上升^[1]。而隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，核磁共振、分析化學(xué)技術(shù)以及質(zhì)譜法的聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)于有機(jī)代謝檢測(cè)起到極大的促進(jìn)作用，這對(duì)于糖尿病早期診斷創(chuàng)造了有利條件。同時(shí)近些年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，胰島素敏感人群和抵抗人群中的外周血液的諸多代謝物質(zhì)中，和胰島素敏感性脂質(zhì)分子并不是相關(guān)性最強(qiáng)的物質(zhì)，而是芳香族氨基酸以及支鏈氨基酸及產(chǎn)物分子。另外還有研究表明，糖耐量不同的患者中經(jīng)過(guò)橫斷面探究得出，糖尿病和支鏈氨基酸聯(lián)系密切。因此，本文為探究支鏈氨基酸作為糖尿病的生物標(biāo)志物，分析血漿氨基酸水平在糖尿病患者中的變化及聯(lián)系，選取我院2017年3月-2018年12月收納的2型糖尿病患者54例作為研究對(duì)象，結(jié)果報(bào)告如下。

1 一般資料與方法

1.1一般資料

選取某院2017年3月-2018年12月收納的2型糖尿病患者54例作為研究對(duì)象，按照糖化血紅蛋白將其分為異常組25例（HbAlc>6.5%），29例正常組（HbAlc<=6.5%），選取于我院的同期體檢的25例健康人組。其中，異常組患者男15例，女10例，年齡為44-73歲，平均年齡為（52.48±6.33）歲。正常組患者男14例，女15例，年齡為42-75歲，平均年齡為（53.50±6.21）歲。健康人組男10例，女15例，年齡為41-76歲，平均年齡為（55.51±6.05）歲。三組患者基線資料無(wú)明顯差異，不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者年齡低于80歲;具有一定自理能力，無(wú)需他人協(xié)助;身體基本健康;診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)糖尿病2型防治指南》2007版;所有受檢者均知情本次實(shí)驗(yàn)研究且經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腎臟疾病于早期診斷，如自身免疫性疾病、腎炎以及藥物導(dǎo)致的腎臟疾病;具有冠狀動(dòng)脈心臟疾病，如心絞痛史以及心肌梗死等;（2）腎功能衰竭;（3）伴有嚴(yán)重的肝臟疾病，如肝硬化、脂肪肝等;（4）嚴(yán)重的基礎(chǔ)性疾病，外周動(dòng)脈硬化;（5）精神病史或意識(shí)不清者;（6）急性感染、、自身免疫力疾病、惡性腫瘤;（7）先天性心臟病及其它心腦血管疾病者;（8）哺乳期婦女、孕期女性。

1.2糖尿病診斷依據(jù)

口服葡萄糖耐量試驗(yàn)的2h血漿葡萄糖超過(guò)或等于200mg/dl或FPG超過(guò)或等于126mg/dl;前期糖尿?。篎PG處于100mg/dl及125mg/dl之間;或OGTT血漿2h葡萄糖處于75-199mg/dl之間。

1.3方法

本次實(shí)驗(yàn)儀器選用有：美國(guó)公司AB Sciex的串聯(lián)質(zhì)譜儀（API 4000）;日本島津公司出品的液相系統(tǒng)：兩臺(tái)輸液泵（LC-20AD）、1臺(tái)子宮進(jìn)樣器（SIL-HTc）、1臺(tái)在線脫氣儀（DGU-20A3）、1臺(tái)控制器（CBM-20A）。美國(guó)AB Sciex出品的mino Acid4.6*150mmC18分析柱;Analyl1.5.1數(shù)據(jù)處理和采集軟件。

空腹血糖監(jiān)測(cè)時(shí)，于第二日早8點(diǎn)取靜脈血液3-5ml，注意保持空腹。進(jìn)行抽血樣品采集和預(yù)處理：將血清等置于冰箱（78℃）冷凍保存。（1）蛋白稀釋和沉淀，沉淀通過(guò)磺基水楊酸10ul以及樣本40ul混合;標(biāo)記緩沖液40ul加上清液10ul;取上清液稀釋的約10ul將其換至離心管中，注意離心管無(wú)菌消毒。（2）標(biāo)記iTRAQ，取iTRAQ115待其溫度至室溫，稀釋加70ul異丙醇;然后加入稀釋的iTRAQ115 5ul于預(yù)處理樣品中，反應(yīng)時(shí)間需保持30分鐘;標(biāo)記反應(yīng)終止時(shí)可加羥胺NH₂OH;使用氮?dú)怙L(fēng)干。（3）樣品重組以及iTRAQ114試劑配制，iTRAQ114在混旋之后底部沉入;加入標(biāo)準(zhǔn)稀釋液1.8ml于iTRAQ114標(biāo)準(zhǔn)液中，混合混勻約一分鐘，直至沉淀消失;iTRAQ115標(biāo)記樣本吹干后混加iTRAQ114稀釋且重組的32ul標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.1液相條件

水相：七氟丁酸水0.01%，甲酸0.1%。有機(jī)相：七氟丁酸乙腈0.01%，甲酸0.1%。氨基酸分析時(shí)，2ul進(jìn)樣量、50℃柱溫、0.8ml/min流速。

1.2.3質(zhì)譜條件 ?掃描方式：MRM;電噴霧離子源;極性為正離子;掃描間隔時(shí)間10ms;電壓設(shè)置為5500V;溫度設(shè)置為500℃;儀器參數(shù)有：EP（10V）、DP（20V）、CXP（5V）、CE（30V）。

1.3.2檢測(cè)

氨基酸：體內(nèi)氨基酸需同時(shí)監(jiān)測(cè)通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用方式進(jìn)行（AB Amino Acid45/32TM Kit）。沉淀蛋白樣品后，氨基酸衍生化通過(guò)iTRAQ115衍生化試劑進(jìn)行。氨基酸濃度標(biāo)記為114標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)未知濃度樣品標(biāo)記^[2]。氨基酸測(cè)定種類又：蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及絲氨酸等成糖氨基酸;異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸等支鏈氨基酸;賴氨酸、亮氨酸等成酮氨基酸。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將研究所得的最后數(shù)據(jù)使用spss22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，t值檢驗(yàn)計(jì)量資料，卡方檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料，組間差異經(jīng)P值判定，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

異常組和正常組在成酮氨基酸（賴氨酸和亮氨酸）以及支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸）水平均較健康人組顯著更高（P<0.05），同時(shí)正常組水平升高幅度低于異常組（P<0.05）;異常組和正常組在成糖氨基酸（絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及蘇氨酸）水平和健康人組顯著減少（P<0.05），而異常組減少水平比異常組更顯著（P<0.05）。

3 討論

糖尿病患者在全球范圍內(nèi)患病人數(shù)極多，目前以接近4億。而2型糖尿病患者現(xiàn)在任然不清楚其發(fā)病機(jī)制，但臨床學(xué)者也達(dá)成普遍共識(shí)，即高血脂、高血糖以及細(xì)胞因子屬于β細(xì)胞和IR細(xì)胞分泌缺陷的主要機(jī)制^[3]。作為人體必需的氨基酸之一，支鏈氨基酸被制成營(yíng)養(yǎng)劑在臨床中廣泛應(yīng)用。支鏈氨基酸的研究較早，于上世紀(jì)五六十年代，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)血清中支鏈氨基酸出現(xiàn)水平上升。相關(guān)研究表明，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等代謝組學(xué)方案對(duì)相關(guān)糖尿病患者對(duì)照研究得出，芳香族氨基酸以及支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸）等當(dāng)其水平提高時(shí)，糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)就大大增加。而經(jīng)過(guò)氨基三羧酸循環(huán)后，可將葡萄糖、氨基酸以及脂質(zhì)代謝緊密結(jié)合。等可氨基酸代謝生酮氨基酸和糖，其具有與糖脂代謝轉(zhuǎn)化的能力。而氨基酸代謝異常可由糖代謝紊亂造成，相反，糖代謝異常也可由氨基酸代謝異常造成。而近些年來(lái)醫(yī)療技術(shù)以及生物科學(xué)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，越來(lái)越多的臨床研究者發(fā)現(xiàn)，糖類代謝結(jié)果和氨基酸代謝等相關(guān)間的影響緊密，得到了人們廣泛關(guān)注。李偉，童星^[4]等人通過(guò)對(duì)糖尿病模型小鼠的血漿氨基酸組分采取HPLC法進(jìn)行分析乳清蛋白后發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白中異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸等在氨基酸總量中占比分別為5.92%、14.39%、5.31%，即總含量上支鏈氨基酸占比超過(guò)25%。但在造模鼠和正常鼠中，灌胃了乳清蛋白的支鏈氨基酸血漿含量顯著增加，同時(shí)支鏈氨基酸濃度隨著灌胃濃度升高而升高，且支鏈氨基酸濃度正常鼠含量遠(yuǎn)低于造模鼠，該結(jié)果提示出，血漿中氨基酸水平可能會(huì)對(duì)葡萄糖的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)造成阻礙，使得肌糖原合成減少，從而誘發(fā)胰島素抵抗。而常盼，張曉萌^[5]等為驗(yàn)證糖尿病心肌患者中血漿支鏈氨基酸水平表達(dá)通過(guò)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，兩組患者中，糖尿病心肌患者的支鏈氨基酸（0.998±0.076）mM與對(duì)照組（0.135±0.068）mM相比其血漿含量發(fā)生明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而對(duì)糖尿病心肌患者通過(guò)Tei指數(shù)和血漿支鏈氨基酸的相關(guān)性比較統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)兩者間呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.820，P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。還有學(xué)者通過(guò)對(duì)2型糖尿病進(jìn)行測(cè)定血漿氨基酸發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的血漿氨基酸變化具有獨(dú)特性，主要為成酮氨基酸、支鏈氨基酸等水平增加，而成糖氨基酸濃度則呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，同時(shí)正常人群受試者丙氨酸水平則不明顯差異，這與本文中研究結(jié)果保持一致，因胰島細(xì)胞內(nèi)科通過(guò)谷氨酸進(jìn)行信息傳遞，對(duì)胰島素分泌具有影響作用，臨床大量研究也證實(shí)胰島素分泌可由氨基酸所影響決定，這也為糖代謝受氨基酸影響相關(guān)理論奠定基礎(chǔ)^[6]。而本文中，通過(guò)將糖尿病患者按照糖化血紅蛋白水平分為異常組和正常組，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證得出，異常組和正常組在成酮氨基酸（賴氨酸和亮氨酸）以及支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸）水平均較健康人組顯著更高（P<0.05），同時(shí)正常組水平升高幅度低于異常組（P<0.05）;異常組和正常組在成糖氨基酸（絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及蘇氨酸）水平和健康人組顯著減少（P<0.05），而異常組減少水平比異常組更顯著（P<0.05），結(jié)果符合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告。本文結(jié)果提示出該機(jī)理和以下因素可能存在關(guān)聯(lián)：在發(fā)生糖代謝障礙后，糖尿病患者因胰島素缺乏而通常發(fā)生蛋白質(zhì)代謝異常，而作為代謝性疾病的一種，糖尿病因胰島素相對(duì)不足或不足進(jìn)而造成阻礙脂肪酸、葡萄糖氧化，增加蛋白分解等，這也在一定程度上解釋了為何運(yùn)動(dòng)員多采取補(bǔ)充相關(guān)氨基酸作為能源支持^[7]。此外，如肝外的支鏈氨基酸降解也會(huì)因支鏈酮酸脫氫酶的活力降低而有所影響。機(jī)體內(nèi)肌肉組織在對(duì)支鏈氨基酸進(jìn)行攝入時(shí)因胰島素不足而受到抑制，進(jìn)而造成肌肉分解代謝亢進(jìn)效果，成酮氨基酸和支鏈氨基酸因氨基酸產(chǎn)生過(guò)多而出現(xiàn)上升。值得注意的是，因肝臟中幾乎所有氨基酸分解代謝均在其中進(jìn)行，當(dāng)患者肝臟器官功能發(fā)生減弱異常時(shí)，則血漿中其它必須氨基酸增上升。因此，王思陽(yáng)、徐蓉^[8]等認(rèn)為，對(duì)于血漿支鏈氨基酸含量過(guò)多患者，可通過(guò)葡萄糖快速靜滴或者胰島素靜脈注入從而對(duì)內(nèi)生胰島素分泌進(jìn)行刺激，以降低血漿支鏈氨基酸含量;還可口服降糖藥以及胰島素注射后，糖尿病患者的氨基酸代謝異常以及代謝失調(diào)等可得以糾正。

總而言之，針對(duì)2型糖尿病患者的疾病和代謝狀態(tài)通過(guò)檢驗(yàn)支鏈氨基酸等血漿氨氨基酸水平可反映出二者之間存在一定聯(lián)系，而代謝組學(xué)對(duì)于疾病研究起到促進(jìn)作用，有利于糖尿病患者早期的診斷。

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