陳珊珊， 易敏春， 周國忠， 普躍昌， 韓米華， 胡毅， 金華

楚雄醫(yī)藥高等?？茖W校 1外科教研室 2內(nèi)科教研室(云南楚雄 675000)； 3云南省第一人民醫(yī)院麻醉科(云南昆明650031)

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemic reperfusion injury, SCIRI)指在脊髓缺血引起的原發(fā)性脊髓損傷基礎(chǔ)上，由于恢復(fù)血流再灌注而引發(fā)的一系列繼發(fā)性神經(jīng)細胞損害，嚴重者發(fā)生不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能障礙，甚至截癱，是脊髓供血動脈疾患、脊柱損傷、腹主動脈瘤或胸腹主動脈瘤等手術(shù)后嚴重并發(fā)癥之一。近年來，干細胞移植治療SCIRI成為研究的熱點。間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有來源廣、易取材、免疫排斥反應(yīng)弱、多向分化潛能及分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子等優(yōu)點[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)中風患者血清激活人BMSCs高表達血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進其神經(jīng)恢復(fù)[4]。本研究組的前期研究發(fā)現(xiàn)BMSCs腎下腹主動脈移植一方面能減輕SCIRI大鼠脊髓缺血區(qū)神經(jīng)元的壞死，另一方面可促進上下行神經(jīng)纖維再生[5]，可見動脈移植BMSCs是治療SCIRI的一種有效的新手段。而這二者之間是否具有某種內(nèi)在聯(lián)系？為進一步明確BMSCs動脈移植治療SCIRI大鼠的作用機制，我們于2017年7月至2018年7月觀察移植BMSCs后的SCIRI大鼠脊髓缺血區(qū)AKT、Bcl-2、Bax和VEGF表達的變化，探討血管再生機制在BMSCs動脈移植治療SCIRI中的作用，為動脈移植BMSCs治療SCIRI提供更有利的實驗支持。

1 材料與方法

1.1 BMSCs體外培養(yǎng)、CD44鑒定及VEGF染色 脫頸椎法處死20 d SD乳鼠10只，在無菌條件下，剝離出雙側(cè)股骨，收集股骨中的骨髓進行原代、傳代培養(yǎng)，傳至第3代的BMSCs進行CD44和VEGF染色后用于移植。細胞培養(yǎng)及CD44、VEGF染色詳細步驟見本研究組先前研究[5]。

1.2 動物分組與模型制備 24只成年雌性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、對照組和移植組，每組8只，水合氯醛麻醉。SCIRI模型采用切斷腎上腹主動脈的分支椎動脈、綁扎阻斷腎下腹主動脈血流2 h后復(fù)通動脈恢復(fù)脊髓再灌注[6]。假手術(shù)組未切斷、阻斷動脈，手術(shù)過程同SCIRI模型。對照組經(jīng)腎下腹主動脈阻斷脊髓灌注2 h恢復(fù)再灌注5 min后，經(jīng)股動脈置管推注10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基1 mL。移植組恢復(fù)再灌注5 min后置管推注BMSCs懸液1 mL(1×106cell/mL)。術(shù)畢對所有大鼠進行嚴格止血、逐層縫合、青霉素抗感染及二便護理。

1.3 神經(jīng)行為學(BBB)評價 應(yīng)用Basso等[7]的BBB評分體系，分0～21級，包括大鼠后肢的運動、步態(tài)、協(xié)調(diào)性，軀干位置及穩(wěn)定性，爪的擺放，足趾間隙和尾的位置等方面。滿分21分，最低分為0分，雙盲條件下由專業(yè)實驗人員于術(shù)后0、4、8和14 d完成評分，取均值比較。

1.4 運動誘發(fā)電位(MEP)測定 參照文獻[8]方法：術(shù)后14 d，保持受試動物清醒、俯臥位固定，經(jīng)顱磁刺激(transcranial magnetic stimulation, TMS)刺激儀包括圓形刺激線圈(2×10匝，內(nèi)、外徑分別為10 mm、50 mm)、記錄電極、參考電極及表面電極等核心部件，記錄電極和參考電極針刺入腓腸肌，表面電極黏附于大鼠耳朵，磁力板中心置于大腦皮質(zhì)運動區(qū)，以40%的刺激量單次刺激，重復(fù)刺激3～5次，信號采集系統(tǒng)描記和保存可重復(fù)的波形，標記潛伏期和波幅。

1.5 皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)測定 MEP檢測完成后1 h測定CSEP，方法：左下肢脛后神經(jīng)放置刺激電極，鼻正中皮下放置參考電極，右側(cè)大腦皮下連接記錄電極，耳朵與接地電極相連。參數(shù)：濾波高頻、低頻分別為2 kHz和10 Hz，靈敏度10 μV/D，掃描速度10 ms/D，刺激強度控制在出現(xiàn)后爪抖動為宜。檢測結(jié)果為記錄的300次波疊加平均值。

1.6 標本處理 所有實驗動物于術(shù)后14 d取材，水合氯醛麻醉，酒精浸泡消毒，撬開椎管(所有器械經(jīng)滅菌、去RNA酶預(yù)處理)、游離L1、L2脊髓分存入2支去酶的EP管，-80℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 RT-PCR檢測脊髓AKT、Bax、Bcl-2和VEGF mRNA表達 裂解、萃取提取總RNA，并鑒定其純度和完整性。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增, 以反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板擴增，設(shè)置：94℃預(yù)變性5 min、變性和退火各1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃ 總延伸10 min，10℃冷卻。VEGF引物上游序列為5′-TACCCCGATGAGATAGAG-3′，下游序列為5′-TTGGACAAACAAATGCTT-3′，退火溫度47℃，擴增產(chǎn)物348 bp。AKT引物上游序列為5′-CAGGTTCACCCAGTGACAACTCA-3′，下游序列為5′-CACGAGACAGGTGGAAGAAGAGC-3′，退火溫度57℃，擴增產(chǎn)物360 bp。Bax引物上游序列為5′-GTTTCATCCAGGATCGAGCAGA-3′，下游序列為5′-GGAGTCCGTGTCCACGTCAG-3′，退火溫度56℃，擴增產(chǎn)物258 bp。Bcl-2引物上游序列為5′-CCCCTGGCATCTTCTCCTTCC-3′，下游序列為5′-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′，退火溫度58℃，擴增產(chǎn)物448 bp。設(shè)置內(nèi)參對照β-actin。β-actin引物上游序列為5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′,下游序列為5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，退火溫度52.5℃，擴增產(chǎn)物227 bp。擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠、1∶ 20 000 GoldView顯色、1%TAE電極緩沖液(180 V)電泳檢測，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像。Image軟件測量光密度，取各因子相對光密度比值比較，相對光密度比值=該因子光密度值/β-actin光密度值。

1.8 Western blot檢測脊髓VEGF、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白的表達 組織裂解、勻漿、靜置、離心提蛋白，15%分離膠電泳、電轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶粉4℃封閉過夜，孵育一抗鼠Anti-rat VEGF(1∶ 500，Chemicon)、兔Anti-AKT及抗磷酸化鼠Anti-rat p-AKT(1∶ 500，Cell signaling technology公司)、兔Anti-Bax及兔Anti-Bcl-2(1∶ 1 000，Cell signaling technology公司)搖床上孵育70 min，鼠Anti-rat β-actin(1∶ 2 000，Santa Cruz)蛋白作為內(nèi)對照。洗膜后，室溫下?lián)u床上孵育goat anti-mouse IgG二抗(1∶ 5 000，Santa Cruz)70 min。增加化學發(fā)光(ECL)試劑盒顯影曝光成像，Quantity one軟件測光密度值，取各特異性蛋白條帶光密度值與β-actin光密度值之比進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs培養(yǎng)及CD44、VEGF染色情況 接種第2天，細胞胞體呈圓形且貼壁不穩(wěn)固，偶見數(shù)個細胞呈索形，長出短突起；4～5 d，細胞胞體呈索形或三角形，兩端長出短突起；7 d，細胞基本覆蓋滿板底，胞體較前扁平，細胞形態(tài)、極性較一致，呈漩渦狀生長(圖1-A)。培養(yǎng)至第3代的BMSCs細胞形態(tài)、極性與7 d時的細胞保持一致。CD44免疫染色顯示，棕黃色CD44免疫陽性產(chǎn)物廣泛分布于細胞胞漿和突起，圓形或橢圓形胞核未著色，蘇木素復(fù)染呈現(xiàn)淡藍色(圖1-B)。細胞胞漿和突起均見棕色VEGF免疫陽性產(chǎn)物，而胞核和核仁著色淺，蘇木素復(fù)染呈現(xiàn)淡藍色(圖1-C)。

A：體外培養(yǎng)的BMSCs活細胞；B：BMSCs內(nèi)CD44免疫陽性產(chǎn)物的分布；C：BMSCs內(nèi)VEGF免疫陽性產(chǎn)物的分布

2.2 BBB評分 對照組和移植組大鼠BBB評分于術(shù)后0、4、8、14 d均顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)；術(shù)后4、8、14 d，移植組BBB評分均較對照組高(P<0.01)，且對照組和移植組組內(nèi)不同時間點BBB評分隨時間推移而增高(P<0.01)。見表1、圖2。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時刻BBB評分比較(n=8) 分

*與假手術(shù)組比較Ρ<0.01；△與對照組比較Ρ<0.01；▲與同組前一時間點比較Ρ<0.01

*與假手術(shù)組比較P<0.01；△與對照組比較P<0.01；▲與同組前一時間點比較P<0.01

圖2各組大鼠術(shù)后不同時刻BBB評分

2.3 神經(jīng)電生理檢測 術(shù)后14 d，對照組和移植組較假手術(shù)組MEP、CSEP潛伏期延長(P<0.01)，波幅減小(P<0.01)；且這種變化在對照組更顯著(P<0.01)，移植組次之(P<0.01)。見圖3、表2。

2.4 L1脊髓VEGF、AKT、Bax和Bcl-2 mRNA表達 術(shù)后14 d，與假手術(shù)組比，對照組和移植組AKT、Bax和Bcl-2 mRNA表達水平顯著增加(P<0.01)，且移植組VEGF mRNA表達亦增加(P<0.01)。與對照組比較，移植組僅Bax mRNA表達較減少(P<0.01)，其余因子表達均增加(P<0.01)。見圖4-A、表3。

圖3 各組大鼠術(shù)后14 d行為電生理(n=8)

項目MEPCSEP潛伏期(ms)波幅(mV)潛伏期(ms)波幅(mV)假手術(shù)組4.74±0.182.97±0.134.30±0.184.35±0.13對照組8.52±0.38?1.03±0.10?9.78±0.26?1.43±0.15?移植組6.78±0.29?△1.64±0.12?△6.73±0.26?△2.51±0.13?△F值41.1473.84135.10117.60P值0.0000.0000.0000.000

*與假手術(shù)組比較P<0.01；△與對照組比較P<0.01

2.5 L2脊髓VEGF、AKT、p-AKT、Bax和Bcl-2蛋白的表達 術(shù)后14 d，各組大鼠L2脊髓均檢測到VEGF、AKT、p-AKT、Bax和Bcl-2蛋白表達(圖4-B)。除VEGF蛋白表達僅在移植組顯著增加外(P<0.01)，其余各蛋白在對照組和移植組的表達水平均較假手術(shù)組增加(P<0.01)；而移植組僅Bax較對照組表達減少(P<0.01)，其余各蛋白表達均增加(P<0.01)。見表4。

3 討論

本課題組實驗采用切斷腎上腹主動脈的分支椎動脈、綁扎阻斷腎下腹主動脈血流2 h后復(fù)通動脈恢復(fù)脊髓再灌注的方法制備SCIRI模型[6]。假手術(shù)組大鼠在術(shù)后各時間點BBB評分均介于20～21分，而對照組和移植組大鼠術(shù)后當天BBB評分幾乎為0分，隨著時間的推移，BBB評分逐漸增加，且移植組大鼠BBB評分達到4～11分,均高于對照組。在術(shù)后14 d，對照組和移植組大鼠較假手術(shù)組大鼠MEP和CSEP潛伏期明顯延長、波幅顯著減小，而這種變化在移植組有所縮小。說明本實驗采用的SCIRI模型成功地呈現(xiàn)了大鼠的SCIRI，大鼠后肢出現(xiàn)了嚴重功能障礙，而腎下腹主動脈移植BMSCs能有效地促進損傷后大鼠后肢功能恢復(fù)。

BMSCs不僅具有干細胞的多向分化和自我更新的潛能，而且能經(jīng)動靜脈如頸內(nèi)動脈、尾靜脈等移植途徑穿越血腦屏障向外傷性腦損傷病變部位遷移[9]，大量表達和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子與外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子一起共同發(fā)揮神經(jīng)保護作用，而VEGF正是其中一員[10-11]，本實驗研究也證實體外培養(yǎng)的BMSCs能表達VEGF，且經(jīng)腎下腹主動脈移植BMSCs后增加了SCIRI大鼠病灶脊髓局部VEGF基因和蛋白表達。VEGF是一種特異的促血管內(nèi)皮生長和血管形成的多肽類蛋白，從促進血管基底膜分解及足體環(huán)的形成[12]、介導(dǎo)PI3K-AKT促進內(nèi)皮細胞芽生[13]和調(diào)節(jié)新生血管網(wǎng)絡(luò)的形成與重構(gòu)[14-15]等方面參與到外傷、炎癥及腦卒中后等缺血局部血管新生全過程[16]。但目前尚無VEGF在BMSCs移植治療SCIRI中的作用研究的報道，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs移植促進了SCIRI大鼠脊髓內(nèi)VEGF表達，進而推測BMSCs亦可能通過自分泌和(或)旁分泌VEGF方式參與損傷脊髓后血管和神經(jīng)細胞的病理反應(yīng)，促進血管內(nèi)皮細胞的遷移、新生血管的形成，改善脊髓損傷局部微循環(huán)，間接地保護神經(jīng)細胞免受缺血缺氧損傷，改善大鼠后肢功能。

A：AKT、Bax、Bcl-2和VEGF mRNA在各組大鼠L1節(jié)段脊髓內(nèi)的表達；M：Marker DL2000，條帶從下往上依次為：100、250、500、750、1 000、2 000 bp；B：AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2和VEGF蛋白在各組大鼠L2節(jié)段脊髓內(nèi)的表達

圖4VEGF、AKT、Bax及Bcl-2在各組大鼠脊髓中的表達

項目VEGFAKTBaxBcl-2假手術(shù)組1.13±0.081.25±0.090.93±0.091.09±0.10對照組1.26±0.11.57±0.10?1.97±0.10?1.43±0.11?移植組1.94±0.11?△2.05±0.10?△1.46±0.11?△1.97±0.11?△F值19.9517.0026.6916.32P值0.0000.0000.0000.000

*與假手術(shù)組比較P<0.01；△與對照組比較P<0.01

項目VEGFAKTp-AKTBaxBcl-2假手術(shù)組1.19±0.071.29±0.061.34±0.100.95±0.061.19±0.09對照組1.38±0.061.55±0.07?1.65±0.09?1.95±0.06?1.73±0.10?移植組1.98±0.08?△2.03±0.08?△2.17±0.13?△1.52±0.05?△2.26±0.12?△F值37.0226.6315.4575.9427.62P值0.0000.0000.0000.0000.000

*與假手術(shù)組比較P<0.01；△與對照組比較P<0.01

研究表明VEGF主要通過其下游PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)/AKT(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在內(nèi)皮細胞增殖、分化、凋亡方面發(fā)揮重要作用[17]。活化后的AKT即p-AKT通過抑制或激活下游靶蛋白Bax、Bcl-2等，發(fā)揮誘發(fā)細胞生長、促進細胞存活的生物學效應(yīng)，實現(xiàn)促進腦缺血后血管內(nèi)皮細胞增殖和阻止細胞凋亡發(fā)生[18]，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在BMSCs移植治療SCIRI中是否也發(fā)揮著生物學效應(yīng)仍不得而知。本實驗中BMSCs移植增加了SCIRI大鼠病灶脊髓內(nèi)VEGF、AKT、p-AKT、Bcl-2基因和蛋白表達，而降低了Bax基因和蛋白表達，說明經(jīng)腎下腹主動脈移植入SCIRI大鼠體內(nèi)的BMSCs可能是通過VEGF介導(dǎo)PI3K/AKT途徑，激活其下游靶蛋白Bcl-2和抑制下游靶蛋白Bax來促進血管內(nèi)皮細胞增殖、分化和抗細胞凋亡的發(fā)生，從而促進病灶局部血管新生，改善局部微環(huán)境，進而促進SCIRI大鼠脊髓修復(fù)，實現(xiàn)后肢功能改善。但在本研究設(shè)計中并未涉及損傷脊髓局部血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元細胞的增殖、分化、遷移以及局部新生血管形成的檢測觀察，尚缺乏BMSCs移植通過VEGF促進SCIRI大鼠缺血脊髓局部的神經(jīng)微血管網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的直接證據(jù)，這將是本研究組下一步亟需解決的問題。

綜上所述，腎下腹主動脈移植BMSCs通過增加脊髓損傷病灶局部VEGF的表達，進而介導(dǎo)其下游信號通路PI3K/AKT促進脊髓缺血再灌注損傷大鼠脊髓功能恢復(fù)。該研究成果將成為推動BMSCs動脈移植治療SCIRI在臨床應(yīng)用的重要依據(jù)，同時也是進一步探討其治療機制的實驗基礎(chǔ)。