楊靜, 史貽玉△, 沈沛陽, 陳海波, 朱明月, 李偉

1中山大學(xué)中山眼科中心海南眼科醫(yī)院(海南省眼科醫(yī)院)、海南省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(一病區(qū))(海南?？?570311) ； 2海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(海南?？?570102)

青光眼主要以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡為主，導(dǎo)致視神經(jīng)乳頭發(fā)生損傷，進(jìn)行性視野缺失為主要特征的不可逆性病變，已經(jīng)成為全球第一不可逆致盲性眼病[1]。而在青光眼發(fā)生中眼壓升高則是主要危險(xiǎn)因素。目前，臨床上對(duì)于青光眼發(fā)病機(jī)制尚不完全知曉，主要以降低眼壓、保護(hù)視神經(jīng)為主[2-3]。部分患者盡管眼壓已經(jīng)得到有效的控制并使用視神經(jīng)保護(hù)藥物，但是視功能損害仍在繼續(xù)。因此，加強(qiáng)青光眼發(fā)病機(jī)制、治療方法研究具有重要的臨床意義[4-5]。2015年6月至2017年12月本文主要選擇清潔級(jí)雌性Wistar大鼠30只作為對(duì)象，探討大鼠青光眼應(yīng)激模型中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞PTEN基因表觀遺傳修飾及表達(dá)的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇清潔級(jí)雌性Wistar大鼠30只作為對(duì)象，隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組10只、模型組10只、模型+藥物干預(yù)組(甲鈷胺處理)10只。30只Wistar大鼠體重86～95 g，平均(90.35±0.83)g，所選動(dòng)物均由醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。Wistar大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食，實(shí)驗(yàn)均通過醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 主要儀器和試劑 通用型SP免疫組化檢測試劑盒、DAB Kit酶底物顯色試劑盒、白洋 G16 型臺(tái)式高速離心機(jī)、中性樹膠、石蠟切片機(jī)(LEICA-RM2235 型)、光學(xué)顯微鏡及Msho數(shù)字成像系統(tǒng)、生物組織攤烤片機(jī)及PCR儀等。見表1。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立及處理方法 (1)動(dòng)物模型建立[6-7]。除正常對(duì)照組外，其余大鼠均建立大鼠青光眼應(yīng)激模型，右眼為誘導(dǎo)高眼壓眼，左眼為對(duì)照眼。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.2～0.3 mL/100 g)全身麻醉，沿角膜緣剪開上方和外側(cè)球結(jié)膜，分離上直肌兩側(cè)或下方的2支和外直肌一側(cè)或下方的1支鞏膜上靜脈，燒灼鞏膜上靜脈，縫合球結(jié)膜。術(shù)前、術(shù)后1周內(nèi)每天，1月內(nèi)隔天，1月后2次/周用Tono-penXL筆式眼壓計(jì)測量眼壓，每只大鼠測量5次，取平均值[8-9]。(2)處理方法。建模完成后模型組不采取任何措施處理，正常對(duì)照組不參與建模，模型組+藥物干預(yù)組建模成功后采用甲鈷胺進(jìn)行處理，兩組均干預(yù)11周[3]。

表1 主要儀器和試劑

1.3.2 凋亡小體、caspase-3、PTEN細(xì)胞定位和PTEN表達(dá) (1)凋亡小體、caspase-3、PTEN細(xì)胞定位。處死大鼠，摘取眼球，分離視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)用4%多聚甲醛固定，利用DAPI和PITC染色，熒光鏡觀察凋亡小體、caspase-3、PTEN細(xì)胞定位[10]。(2)PTEN表達(dá)。①測定方法。采用免疫組織化學(xué)觀察PTEN的表達(dá)。取大鼠眼部組織，制備細(xì)胞切片，向切片組織中放入1份30.0%H2O2及10份蒸餾水，加入內(nèi)源性酶常溫下滅火10 min，采用蒸餾水連續(xù)洗滌3次。將切片放置在枸櫞酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，利用電爐加熱，煮沸后間隔5 min再次煮沸，反復(fù)2次，常溫下冷卻后加入PBS洗滌2次，常溫下加入濃度5%BSA封閉液，甩去多余液體后加入一滴PTEN蛋白(稀釋濃度為1∶ 100)單克隆抗體，采用PBS 洗滌3次，每次 2 min。采用DBA顯色試劑盒中在1 mL底物中加入1滴PTEN蛋白二抗，混合均勻后制備DBA工作液，常溫下顯色，完畢后利用蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封片，倒置顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的比例，每個(gè)標(biāo)本測定3次，取平均值[11]。②判定方法。以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒或團(tuán)狀視為陽性。參考奧爾雷德評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)從細(xì)胞陽性數(shù)(1～4分)及染色強(qiáng)度(0～12分)進(jìn)行判斷，得分越高，陽性率越高。評(píng)定時(shí)每個(gè)標(biāo)本連續(xù)測定3次，在200倍光鏡下取5個(gè)視野，取平均值。

1.3.3 PTEN和AKT(Ser473)表達(dá)量 采用Western blot分析RGCs的PTEN和AKT(Ser473)表達(dá)量。各組大鼠處理完畢后殺死大鼠并取球囊區(qū)血管組織完成蛋白提??；各區(qū)總蛋白20 μg進(jìn)行Western blot分析，一抗比例設(shè)定為1∶ 500、二抗比例設(shè)定為1∶ 1 000，采用β-actin作為內(nèi)參照，完成 PTEN和AKT(Ser473)表達(dá)量測定[12-13]。

1.3.4 大鼠青光眼模型RGCs的PTEN基因表觀遺傳修飾的改變 制備大鼠青光眼模型(壓力和血液流動(dòng)改變)→在外科手術(shù)處理造模后的1、3、5、7、9、11周的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠→摘取眼球→分離RGCs→組織分為兩份，其中一份檢測PTEN的表達(dá)；另外一份用4%多聚甲醛固定→分離組織DNA，用特異性甲基化-PCR檢測PTEN基因啟動(dòng)子甲基化狀況→用固定的組織作ChIP檢測RGCs的PTEN基因啟動(dòng)子組蛋白(H3K9或H4K8)的乙酰化狀態(tài)→分析各組大鼠RGCs的PTEN基因表觀遺傳修飾的差異[14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行2檢驗(yàn)，采用n(%)表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組處理后不同時(shí)間點(diǎn)雙眼眼壓變化及RGCs凋亡率比較 模型組及模型+藥物干預(yù)組大鼠行右眼鞏膜上靜脈燒灼后，成功建立高眼壓模型，眼壓高于正常對(duì)照組及對(duì)照眼，見表1。模型+藥物干預(yù)組與正常對(duì)照組處理后1、3、5、7、9、11周RGCs凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型+藥物干預(yù)組處理后1、3、5、7、9、11周RGCs凋亡率低于模型組(P<0.05)。見表2。

時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組模型組模型+藥物干預(yù)組IOP右IOP左IOP右IOP左IOP右IOP左術(shù)前11.04±1.8913.21±1.7012.44±1.5613.01±1.6710.99±2.1311.67±1.56術(shù)后1周12.45±2.0911.13±1.9829.87±1.9011.52±1.8428.23±1.7811.72±1.86術(shù)后3周10.98±1.9112.64±1.8527.67±1.8710.98±1.9127.86±1.3412.45±2.09術(shù)后5周13.56±1.7910.78±2.0625.78±1.5612.43±1.4525.67±1.3613.21±1.70術(shù)后7周11.78±2.6511.72±1.8623.85±1.9011.13±1.9824.78±1.4510.98±1.94術(shù)后9周12.43±1.4510.98±1.9423.45±1.4512.64±1.8523.48±1.3913.56±1.79術(shù)后11周11.52±1.8413.32±1.8823.32±2.1512.45±2.0923.04±1.9512.64±1.85

組別1周3周5周7周9周11周模型+藥物干預(yù)組0.32±0.07△1.21±0.23△1.59±0.31△1.86±0.44△2.12±0.51△2.35±0.56△模型組6.74±0.139.79±0.5413.43±0.4418.58±0.8432.41±3.2154.29±4.51正常對(duì)照組0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00

△與模型組比較P<0.05

2.2 3組大鼠PTEN陽性率比較 模型+藥物干預(yù)組與正常對(duì)照組PTEN陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠PTEN陽性率比較 只(%)

*與模型+藥物干預(yù)組比較P<0.05

2.3 3組PTEN和AKT(Ser473)表達(dá)量比較 Western blot結(jié)果表明：模型+藥物干預(yù)組PTEN表達(dá)量低于模型組和正常對(duì)照組(P<0.05)；模型+藥物干預(yù)組AKT(Ser473)表達(dá)量高于正常對(duì)照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)。見圖2。

2.4 3組大鼠PTEN基因啟動(dòng)子組蛋白(H3K9或H4K8)比較 模型+藥物干預(yù)組PTEN基因啟動(dòng)子組蛋白陽性率與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均高于模型組(P<0.05)。見表4。

A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：模型+藥物干預(yù)組

圖2 3組PTEN和AKT(Ser473)表達(dá)量比較

表4 3組大鼠PTEN基因啟動(dòng)子組蛋白(H3K9或H4K8)比較 例(%)

△與模型組比較P<0.05

3 討論

青光眼是以視乳頭凹陷、視野缺損及視力下降為共同特征的疾病，以病理性眼壓增高、視神經(jīng)供血不足為發(fā)病的原發(fā)危險(xiǎn)因素。同時(shí)，青光眼的發(fā)生、發(fā)展還與視神經(jīng)對(duì)于壓力損害的耐受性有關(guān)，成為人類失明的三大致盲眼病之一[15-16]。目前，臨床上對(duì)于青光眼缺乏有效的治療方法，常規(guī)方法以眼壓控制、神經(jīng)營養(yǎng)治療為主，雖然能改善患者癥狀，但是失明率較高，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。

目前，臨床上對(duì)于青光眼致盲機(jī)制尚不完全知曉，其眼內(nèi)損傷主要以視乳頭生理凹陷擴(kuò)大、RGCs凋亡等為主要特征，且臨床上常見學(xué)說包括：傳統(tǒng)機(jī)械學(xué)說、缺血學(xué)說及兩者的混合學(xué)說等均無法完全解釋青光眼的視神經(jīng)損害機(jī)制。國內(nèi)學(xué)者[17]研究表明：青光眼性視神經(jīng)病變中RGCs的死亡主要由RGCs凋亡引起，而RGCs凋亡涉及到細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)的基因的表達(dá)。本研究中，模型組+藥物干預(yù)組處理后1、3、5、7、9、11周RGCs凋亡率，低于模型組(P<0.05)。由此看出：大鼠青光眼應(yīng)激模型建立過程中加強(qiáng)藥物干預(yù)有助于降低RGCs細(xì)胞凋亡率。國內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果顯示：建模后給予藥物干預(yù)能對(duì)PTEN表觀遺傳、修飾產(chǎn)生明顯的影響，能降低RGCs細(xì)胞凋亡率，從而延緩抑制RGCs細(xì)胞增殖、生長及遷移。(1)PTEN能阻斷PI3K途徑能降低RGCs細(xì)胞凋亡率，當(dāng)PTEN水平下調(diào)時(shí)，PIP3去磷酸化為PIP2，降低RGCs細(xì)胞凋亡率[18]。(2)PTEN基因表觀遺傳及修飾發(fā)生變化后能影響血小板源性生長因子誘導(dǎo)的P70、AKt及糖原合成，從而能抑制基質(zhì)與PGGF介導(dǎo)的RGCs細(xì)胞凋亡；(3)抑制細(xì)胞跨越G1-S限制點(diǎn)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)水平，降低RGCs細(xì)胞凋亡率。本研究中，模型組+藥物干預(yù)組與正常對(duì)照組PTEN陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低于模型組(P<0.05)。國內(nèi)學(xué)者研究表明： PTEN能抑制化學(xué)黏度蛋白-1、腫瘤壞死因子等延緩病情發(fā)展，延緩青光眼病情發(fā)展。同時(shí)，PTEN能誘導(dǎo)凋亡、抑制P13K途徑抑制神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)RGCs營養(yǎng)作用[19]。本研究中，Western blot結(jié)果表明：模型組+藥物干預(yù)組PTEN表達(dá)量，低于模型組和正常對(duì)照組(P<0.05)；模型組+藥物干預(yù)組AKT(Ser473)表達(dá)量，高于正常對(duì)照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；模型組+藥物干預(yù)組PTEN基因啟動(dòng)子組蛋白陽性率與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均高于模型組(P<0.05)。提示：PTEN能提高AKT(Ser473)表達(dá)量抑制疾病發(fā)展。同時(shí)，PTEN能改變PTEN基因啟動(dòng)子組蛋白表達(dá)率。

綜上所述，大鼠青光眼應(yīng)激模型中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞PTEN基因表觀遺傳修飾及表達(dá)能產(chǎn)生明顯的影響，通過改變AKT(Ser473)表達(dá)量抑制疾病發(fā)展。