陳歐， 湯展宏， 胡軍濤

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科 (廣西南寧 530021)

膿毒癥是一種由感染引起的生理、病理和生化異常綜合征，可導致器官損害并危及生命，最常見的病原菌是革蘭陰性細菌，細菌表面的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)結(jié)構(gòu)是誘導膿毒癥產(chǎn)生的關(guān)鍵成分[1]。目前膿毒癥的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，雖然真正的發(fā)病率尚不清楚，但保守估計表明，膿毒癥已經(jīng)是全世界范圍內(nèi)造成死亡和危重病的主要原因[2-3]。其高昂的治療費用以及對醫(yī)療資源的巨大消耗，嚴重影響了人類的生活健康、生存質(zhì)量，對人類的生活造成了巨大的威脅。膿毒癥炎癥反應(yīng)中因促炎因子和抗炎因子的調(diào)控、釋放失衡，過度釋放的炎癥因子可以造成內(nèi)皮細胞的損害和血管通透性的增加，從而導致血容量的喪失以及組織細胞水腫，從而引起包括肺組織在內(nèi)的全身靶器官的損害，造成全身性炎癥反應(yīng)。其中急性肺損傷是膿毒癥患者最常見的并發(fā)癥及主要的死亡原因[4]。Toll樣受體是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第一類模式識別受體，是先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間的重要紐帶[5-6]。LPS作為革蘭陰性菌表面的抗原物質(zhì)，與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)結(jié)合時可激活其下游信號傳導通路，引起炎癥介質(zhì)的釋放從而導致機體炎癥反應(yīng)[7-8]。2018年3—9月，本實驗旨在研究TLR4在LPS誘導的膿毒癥肺損傷中的作用及相關(guān)機制，以期為臨床治療提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 LPS(美國Sigma公司)，戊巴比妥鈉(上海西塘生物科技有限公司)，小鼠腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)ELISA試劑盒(艾美捷科技有限公司)，蛋白提取試劑盒(北京Solarbio公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京Solarbio公司)核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)多克隆抗體(美國Abcam公司)，β-actin多克隆抗體(美國Abcam公司)，山羊抗兔二抗(美國Abcam公司)

1.2 實驗動物與分組 雄性普通小鼠(C57BL/10J)和TLR4 基因敲除小鼠(C57BL/10ScNJNJU)各16只，8周齡，體重 22～24 g，均購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，動物合格證號：SCXK(蘇)2015-0001。在恒溫恒濕，相同條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水，進食普通飼料，人工照明12 h/d。整個實驗過程遵從動物實驗倫理委員會要求進行。

按隨機數(shù)字表法將小鼠均分為普通小鼠對照組(wild-type，WT組)、普通小鼠模型組(WT+LPS組)、TLR4基因敲除小鼠對照組(TLR4 knockout，TLR4-ko組)、TLR4基因敲除小鼠模型組(TLR4-ko+LPS組)，每組8只。模型組腹腔內(nèi)注射20 mg/kg LPS[9]，對照組小鼠腹腔內(nèi)注射等體積的生理鹽水，24 h后在戊巴比妥鈉麻醉下經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血后，用眼科剪剪開小鼠胸腔，將肺組織分離取出，放置于盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，洗凈肺表面附著的血液，剪下小鼠右肺，浸泡在多聚甲醛中進行固定，留待后續(xù)做病理切片，余肺置于-80℃冰箱，留待檢測肺組織中NF-κB蛋白含量。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α含量變化 小鼠血液標本在4℃冰箱靜置12 h，然后離心取上清液，置于-20℃冰箱保存，具體操作步驟參照ELISA試劑盒說明書進行，最后采用雙波長讀數(shù)，用酶標儀在450 nm和530 nm波長下分別測量各孔的吸光度值，以兩者的差值作為最終的OD值。

1.3.2 肺組織病理形態(tài)學觀察及肺損傷評分 肺組織在多聚甲醛中固定24 h后，依常規(guī)進行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟處理后以HE染色，在光鏡下觀察肺組織病理學變化，并對肺損傷嚴重程度進行半定量評分：評分標準按照Smith評分體系[10-11]，依據(jù)肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥細胞浸潤、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜的形成等5項指標分別進行肺損傷嚴重程度評分(0分為氣管、肺泡及間質(zhì)均正常；1分為損傷病變范圍小于視野的25%；2分為損傷病變范圍在25%～50%之間；3分為損傷病變范圍在50%～75%之間；4分為損傷病變范圍大于視野的75%)，總分16分，上述各項指標分數(shù)的總和即為肺損傷的總評分。

1.3.3 Western blot檢測肺組織中NF-κB蛋白表達 從-80℃冰箱中取出凍存肺組織，用眼科剪盡量剪碎后放入裂解液，勻漿后收集上清液，用BCA法進行蛋白含量的檢測。將樣品稀釋到合適濃度后進行PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上封閉60 min，加入一抗NF-κB抗體，將膜在4℃下孵育過夜，然后與二抗孵育1 h。通過增強化學發(fā)光法觀察條帶，并在成像儀器中進行定量。其中β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 小鼠取材前一般狀態(tài) WT+LPS組小鼠出現(xiàn)活動度下降，倦怠少食，伴明顯氣促，眼鼻偶見膿白色分泌物等現(xiàn)象，有20%病死率；TLR4-ko+LPS組小鼠癥狀明顯較輕；WT組及TLR4-ko組小鼠精神、進食、活動狀況均未見明顯異常。

2.2 各組小鼠肺組織病理學改變及肺損傷評分 (1)各組小鼠肺組織HE染色后光學顯微鏡下觀察：WT+LPS組鏡下肺泡腔內(nèi)可見炎性細胞浸潤、肺泡壁毛細血管擴張、充血明顯，且伴有肺泡擴張不均勻，部分肺泡萎陷、破裂、融合，肺泡壁增厚、肺泡間隔的增寬，局灶性肺出血，偶可見透明膜形成；TLR4-ko+LPS組也可見輕度肺泡壁毛細血管擴張、出血，炎癥細胞浸潤，肺泡壁增厚的表現(xiàn)，但未見明顯肺泡塌陷、破壞。WT組及TLR4-ko組肺泡形態(tài)大小正常，肺泡壁清晰可見，無肺泡紊亂和肺泡塌陷，肺間質(zhì)中未見明顯炎性細胞浸潤。見圖1。肺損傷評分：與WT組相比，WT+LPS組小鼠肺組織損傷評分顯著增高(P<0.01)，TLR4-ko+LPS組與WT+LPS組相比肺損傷程度明顯減輕(P<0.01)，WT組及TLR4-ko組肺損傷評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

A：TLR4-ko組；B：WT組；C：TLR4-ko+LPS組；D：WT+LPS組

2.3 血清TNF-α的表達水平 ELISA結(jié)果顯示：與WT組比較，WT+LPS組小鼠TNF-α表達水平明顯升高(P<0.01)；TLR4-ko組炎癥介質(zhì)表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05) 。TLR4-ko+LPS組炎癥介質(zhì)表達較WT+LPS 組明顯下降(P<0.01)。見表1。

項目n肺損傷評分(分)TNF-α(ng/L)WT組80.88±0.3513.57±1.51TLR4-ko組80.75±0.4614.12±1.31WT+LPS組86.12±0.99?△80.68±19.05?△TLR4-ko+LPS組82.62±0.91▲33.08±4.74▲F值92.92881.704P值0.0000.000

*與WT組比較P<0.01；△與TLR4-ko+LPS組比較P<0.01；▲與TLR4-ko組比較P<0.01

2.4 肺組織NF-κB蛋白的表達 蛋白條帶可見，WT組小鼠肺組織僅有少量NF-κB蛋白表達，與WT組相比，WT+LPS組NF-κB蛋白表達水平明顯上調(diào)(0.33±0.02vs. 0.66±0.01,P=0.000)。TLR4-ko組和TLR4-ko+LPS組中NF-κB蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(0.50±0.06vs. 0.52±0.04,P=0.597)。此外，WT+LPS組蛋白表達水平高于TLR4-ko+LPS組(0.66±0.01vs. 0.52±0.04,P=0.005)。β-actin為內(nèi)參。見圖2。

3 討論

膿毒癥是由于感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，因宿主對感染微生物的復雜免疫、炎癥反應(yīng)，膿毒癥常導致致命性休克、凝血障礙和多器官功能衰竭甚至死亡，臨床上約半數(shù)的膿毒癥患者常會并發(fā)肺損傷。 近年來盡管隨著醫(yī)療水平的提高，專業(yè)重癥監(jiān)護和肺保護性機械通氣策略的出現(xiàn)，在抗感染和支持性治療方面取得了重大進展，但是很少有治療方法在膿毒癥肺損傷的管理中被證明是有效的，其仍然是重癥監(jiān)護病房住院和死亡的主要原因[12-13]。因此尋找有效的治療策略去克服這一難題是具有重要臨床意義的。

1：WT 組；2：WT+LPS 組；3：TLR4-ko 組；4：TLR4-ko+LPS 組

膿毒癥并發(fā)肺損傷過程中涉及多種途徑和機制，盡管國內(nèi)外對其機制探討進行了很多新的研究，如膿毒癥時IQ模序的三磷酸鳥苷酶活化蛋白1(IQGAP1)及其信號轉(zhuǎn)導所引起的肺血管內(nèi)皮細胞通透性改變[14]，膿毒癥介導交感神經(jīng)興奮毒性引起肺損傷炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[15]，但就目前研究而言，其免疫抑制機制尚未完全清楚。研究表明膿毒癥并發(fā)肺損傷時中性粒細胞在肺內(nèi)聚集活化，釋放大量的炎癥介質(zhì)，并協(xié)同蛋白酶和活性氧對肺泡上皮細胞與肺毛細血管內(nèi)皮細胞造成損傷，使肺泡毛細血管屏障受損，同時上皮損傷不僅有助于水腫液的積聚和促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，還會導致表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生和功能受損以及異常的液體轉(zhuǎn)運，從而導致水腫液的清除受損，影響肺通氣和換氣功能，進一步加重肺損傷程度[16-18]。因此膿毒癥肺損傷的發(fā)生發(fā)展主要是與促炎細胞因子的過度釋放有關(guān)，治療的關(guān)鍵就在于阻斷炎癥因子的大量釋放。

研究表明，肺損傷發(fā)病的起始環(huán)節(jié)、炎癥因子的大量釋放與TLR4的表達、激活有著密切的關(guān)系[19-20]。并且TLR4/NF-κB信號通路是急性肺損傷發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的一個重要的信號通路。當LPS與免疫細胞表面的TLR4、CD14、MD-2組成的復合物結(jié)合后，可啟動激活免疫細胞的信號轉(zhuǎn)導通路[21-22]。免疫細胞，包括巨噬細胞和樹突狀細胞等的激活，通過TLR4胞內(nèi)鏈接蛋白如髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)，激活白細胞介素-1(IL-1)受體鏈接蛋白激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)和信號分子腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6, TRAF6)，啟動炎癥細胞轉(zhuǎn)導通路，激活多種酶和轉(zhuǎn)錄因子，使下游NF-κB抑制性蛋白IκB磷酸化激活，NF-κB得以進入細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的表達，有研究表明NF-κB的活化與急性肺損傷的發(fā)生密切相關(guān)[23]。通過這一系列的級聯(lián)信號傳遞，導致單核巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生釋放大量TNF-α、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-12(IL-12)等炎癥介質(zhì)并促進各種黏附分子的表達[24-25]，當大量炎癥因子經(jīng)血液循環(huán)流至肺部時，TNF-α等前炎癥因子通過上調(diào)肺血管內(nèi)皮細胞中E-選擇素 、黏附分子等的表達，促進中性粒細胞的聚集，激活并釋放大量的溶酶體酶、氧自由基等對內(nèi)皮細胞造成直接的損傷，此外還可正反饋激活TLR4/NF-κB信號通路，引起炎癥因子的爆發(fā)性合成釋放。

在本實驗中我們通過采取小鼠腹腔注射LPS的方法來復制膿毒癥肺損傷模型。與WT組和TLR4-ko組小鼠相比，WT+LPS組小鼠肺組織病理改變明顯，可觀察到肺泡腔內(nèi)炎性細胞浸潤、充血明顯，伴肺泡壁明顯增厚，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞、出血及透明膜形成；TLR4-ko+LPS組小鼠在光鏡下觀察可見輕微炎癥細胞浸潤、出血、肺泡間隔增厚，說明模型建造成功。且WT+LPS組與TLR4-ko+LPS組相比其肺組織損傷程度、肺組織NF-κB蛋白含量以及TNF-α表達水平明顯增加，以上結(jié)果說明TLR4在內(nèi)毒素所致的膿毒癥肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要作用，且TLR4基因缺陷后可以抑制的膿毒癥炎癥因子的大量釋放，并且對其并發(fā)的急性肺損傷有一定保護作用。

綜上所述，內(nèi)毒素感染引起的膿毒癥可以并發(fā)急性肺損傷，這可能與細菌內(nèi)毒素和免疫細胞結(jié)合后通過TLR4/NF-κB信號通路，引起炎癥因子大量釋放，并誘導激活肺泡巨噬細胞及中性粒細胞等炎癥細胞在肺內(nèi)聚集，造成組織損傷有關(guān)。敲除TLR4基因后，可以抑制TLR4/NF-κB信號通路，下調(diào)TNF-α的水平，從而減輕膿毒癥的炎癥反應(yīng)，并可改善肺組織損傷情況。本研究通過TLR4基因敲除小鼠，明確了TLR4在LPS誘導的小鼠膿毒癥肺損傷模型的發(fā)展過程中起重要作用，因此可以通過阻斷TLR4信號傳導通路來減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而為臨床上膿毒癥肺損傷的患者提供新的治療靶點。