馮小金， 程小娥， 馬龍先， 張達穎， 蔣昌宇， 柳濤△

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1醫(yī)學(xué)科研中心， 2麻醉科， 3疼痛科(江西南昌 330006)； 4深圳市南山醫(yī)院韓濟生院士疼痛醫(yī)學(xué)工作站(廣東深圳 518052)

超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子(HCN)通道廣泛分布于哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)，由HCN1～4 4個同源成員組成[1]。HCN通道對神經(jīng)細胞靜息膜電位和興奮性的調(diào)控具有重要作用，其表達及功能的異常改變可致心律失常、癲癇和慢性疼痛等疾病[2-4]。脊髓背角是傷害性信息傳遞和整合的初級中樞[5]，由淺至深分為Ⅰ～Ⅵ層[6]。目前關(guān)于HCN通道在脊髓背角分布的研究多以HCN1、HCN2及HCN4為主，較少涉及HCN3亞型，尚存在不足且具爭議性。有學(xué)者認為HCN1不表達于脊髓背角Ⅱ?qū)覽7-8]，而另一些學(xué)者認為HCN1在Ⅱ?qū)佑斜磉_[9]。近年發(fā)現(xiàn)，脊髓背角HCN通道部分亞型在坐骨神經(jīng)縮窄性損傷(CCI)及奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛模型中表達上調(diào)[1,10],表明其與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)。臨床工作中神經(jīng)病理性疼痛的病因錯綜復(fù)雜，不同疼痛模型的致痛機制也不同[11]，提示HCN通道在不同疼痛模型中的表達變化可能不同。部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎(PSNL)模型是一種常用的模擬外周神經(jīng)損傷后燒灼樣痛的神經(jīng)病理性疼痛動物模型，脊髓背角HCN通道在PSNL中的表達是如何變化的目前尚不明。因此，2017年3月至2018年7月，本研究運用免疫組織化學(xué)與熒光定量PCR方法，觀察了HCN通道4種亞型在大鼠脊髓背角的分布特點及其在PSNL模型中的表達變化，以期為臨床工作中對該類型的神經(jīng)病理性疼痛治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗采用健康SD(Sprague Dawley)大鼠，體重150～250 g，雌雄不拘，均來源于南昌大學(xué)動物中心。動物實驗嚴(yán)格按照《南昌大學(xué)實驗動物管理辦法》和《南昌大學(xué)動物實驗倫理審查》原則進行。實驗大鼠飼養(yǎng)于清潔籠具中，室內(nèi)光照保持12 h/12 h晝夜循環(huán)，室溫控制在22～25℃，自由攝取水和食物。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 抗HCN1～4抗體購自Alomone Labs公司，抗Biotinylated-IB4(IB4)抗體購自Vector Lab公司；Alexa Fluor(AF) 488購自Invitrogen公司，Rhodamine RedTM-X-conjugated Streptavidin(Rhodamine)購自Jackson公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)及熒光定量試劑盒(RR820A)購自Takara公司；基因特異性引物由上海生工公司設(shè)計合成。人工腦脊液組成(mmol/L)：NaCl 117、KCl 3.6、CaCl22.5、MgCl21.2、NaH2PO41.2、NaHCO325、D-glucose 11、ascorbic acid 0.4、sodium pyruvate 2，pH=7.4。封閉液組成：0.3% Triton X-100、1% BSA、1% NDS和0.01 mol/L PBS。人工腦脊液組成成分、Triton X-100及BSA均購自Sigma公司，NDS購自Abcam公司。

1.2.2 儀器 冰凍切片機(CM1950)及振動切片機(VT1000 S)購自Leica公司。激光共聚焦顯微鏡(LSM700)購自Carl Zeiss公司。紫外分光光度計(U2900)購自Hitachi公司。梯度PCR儀(Veriti)及熒光定量PCR儀(StepOnePlus)購自Applied Biosystems公司。Von Frey電子測痛儀(Bio-EVF-4S)購自Bioseb公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色脊髓標(biāo)本制備 給大鼠腹腔注射烏拉坦(1.5 g/kg)麻醉后開胸，首先用預(yù)冷的生理鹽水行心臟灌流約100 mL后，換4%多聚甲醛溶液繼續(xù)灌流約250 mL，待大鼠組織固定后迅速取出腰骶段脊髓，剪去脊髓兩側(cè)附著的神經(jīng)根并剝離脊髓表面的硬脊膜和軟脊膜[12]。然后將脊髓置于4%多聚甲醛溶液(4℃)中固定至少6 h后，置于30%的蔗糖溶液中4℃冷保護3 d。其后將脊髓包埋于OCT膠中，在冰凍切片機(-20℃)下切取厚度為30 μm的橫切片備用。

1.3.2 免疫組織化學(xué)方法 將上述脊髓橫切片采用兩步法進行常規(guī)漂染：一抗(Anti-HCN1～4，1∶ 200； IB4，1∶ 100)4℃孵育3 d；二抗(AF 488，1∶ 500； Rhodamine，1∶ 1 000)4℃孵育過夜。陰性對照實驗在一抗孵育的同時加入與之對應(yīng)相同濃度的抗原肽，其他步驟相同，以此檢測抗體特異性。IB4主要分布于脊髓背角Ⅱ內(nèi)層，是區(qū)分脊髓背角Ⅱ?qū)雍廷髮拥臉?biāo)記物。為更好地觀察HCN通道在脊髓背角的表達情況，我們參照以往研究，將脊髓背角分成6層[6]。激光共聚焦顯微鏡采集圖像，采用ZEN 2010(version 6.0，Carl Zeiss)軟件分別測量大鼠脊髓背角HCN1～4通道亞型的淺層(Ⅰ～Ⅱ)和深層(Ⅲ～Ⅵ)的平均熒光強度，將Ⅰ～Ⅱ?qū)悠骄鶡晒鈴姸茸鳛闃?biāo)準(zhǔn)化1，計算脊髓背角Ⅲ～Ⅵ層相對Ⅰ～Ⅱ?qū)訜晒鈴姸缺戎?，以此反映HCN通道各亞型在脊髓背角淺層和深層的分布特點。

1.3.3 熒光定量PCR方法

1.3.3.1 cDNA的提取 正常SD大鼠或模型及假手術(shù)制備后14 d，腹腔注射烏拉坦深麻醉，以人工腦脊液心臟灌流后取出L4-5段脊髓，振動切片機切取厚度為600 μm的橫切片。取其脊髓背角組織，經(jīng)RNAisoTMPlus裂解、氯仿萃取、異丙醇沉淀及乙醇洗滌等過程后，進行紫外分光光度計定量，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加入反應(yīng)體系及樣本，于梯度PCR儀中行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后所得cDNA存于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 熒光定量PCR反應(yīng) 用逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA產(chǎn)物，根據(jù)熒光定量試劑盒說明書在熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR反應(yīng)。基因特異性引物序列見表1。選取同齡SD大鼠，根據(jù)隨機數(shù)字表法將其隨機分為兩組：模型組(PSNL組)和假手術(shù)組(sham組)。結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)溶解曲線確定產(chǎn)物特異性，根據(jù)StepOnePlus軟件計算得到CT值，以β-actin作為內(nèi)參，將正常SD大鼠HCN1～4的CT值分別與之比較[13]；依2-ΔΔCT法量化PSNL組HCN1～4 mRNA表達值，sham組數(shù)據(jù)平均值作為標(biāo)準(zhǔn)化1。

表1 PCR特異性引物序列

1.3.4 神經(jīng)病理性疼痛模型制備及疼痛行為學(xué)測定 參照Seltzer等[14]方法制備PSNL神經(jīng)病理性疼痛模型。大鼠經(jīng)1.5%異氟烷吸入麻醉后，無菌操作下在右側(cè)股段高位切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)干，用7-0尼龍絲線縫入神經(jīng)干內(nèi)較松結(jié)扎神經(jīng)背側(cè)的1/3～1/2。假手術(shù)組僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎。采用Von Frey電子測痛儀評估術(shù)前，術(shù)后1、3、7、10和14 d機械痛敏，以機械痛閾值(paw withdrawal threshold，PWT)表示。所有行為學(xué)實驗均在雙盲情況下進行。

2 結(jié)果

2.1 HCN通道各亞型在脊髓背角的大體分布 我們在HCN通道1～4亞型在一抗與抗原肽進行預(yù)吸附的陰性對照實驗中并未檢測到熒光信號，而在未進行抗原肽預(yù)吸附的實驗中可見綠色熒光信號，左下角插圖為明場下脊髓片大體觀。見圖1。HCN1～4在脊髓均有分布，在脊髓灰質(zhì)部分染色較深，白質(zhì)部分基本未見染色；HCN通道4個亞型在脊髓背角各層(Ⅰ～Ⅵ層)均有不同程度分布，并以Ⅰ～Ⅱ?qū)泳佣?，以HCN1～4通道在Ⅰ～Ⅱ?qū)拥钠骄鶡晒鈴姸葹楦髯缘膮⒄?，我們發(fā)現(xiàn)Ⅲ～Ⅵ層的HCN1～4平均熒光強度遠低于Ⅰ～Ⅱ?qū)?HCN1～4各亞型在Ⅲ～Ⅵ層的熒光強度分別為Ⅰ～Ⅱ?qū)拥?0.37±0.06)倍、(0.37±0.02)倍、(0.29±0.04)倍、(0.53±0.02)倍(n=3)。見圖2～3。

圖1 HCN通道1～4亞型的抗體特異性

圖2 HCN通道1～4亞型在脊髓背角的大體分布

* 與Ⅰ～Ⅱ?qū)颖容^P<0.05

2.2 HCN通道各亞型在脊髓背角淺層的局部分布情況 HCN1、HCN2及HCN4多在細胞膜或細胞膜以外的區(qū)域表達，HCN3則在整個細胞均有表達。4種亞型中，HCN1和HCN4與IB4共染較明顯，而HCN2和HCN3與IB4共染較少。見圖4。

2.3 HCN通道各亞型的mRNA在脊髓背角的表達 HCN1～4及β-actin的代表性引物擴增曲線和熔解曲線見圖5-A、5-B，可見PCR擴增反應(yīng)已完全，PCR產(chǎn)物具有很高的均一性。熒光定量PCR結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果相似，即HCN1～4 mRNA在脊髓背角均有不同程度表達，它們的表達值分別為0.012 12±0.001 58、0.059 66±0.003 09、0.000 47±0.000 04和0.001 67±0.000 20。HCN2的表達量最高，與HCN1相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HCN1次之，而HCN3和HCN4表達量較少，與HCN1相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(n=5)。見圖6。

2.4 PSNL對脊髓背角HCN通道表達的影響 兩組大鼠術(shù)前的基礎(chǔ)PWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與sham組(n=4)相比，PSNL組(n=4)大鼠PWT在術(shù)后1 d即明顯降低(P<0.05)，并持續(xù)到術(shù)后第14天。見表2。我們在術(shù)后第14天取sham組及PSNL組大鼠右側(cè)脊髓背角組織，對兩組HCN1～4 mRNA表達進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與sham組(n=4)相比，PSNL組(n=4)HCN2 mRNA表達顯著增加，是sham組的(1.34±0.10)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而HCN1、HCN3及HCN4 mRNA表達變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，分別是sham組的(1.24±0.17)倍、(1.86±0.47)倍和(1.40±0.25)倍。見表3。

A:擴增曲線;B:熔解曲線

*與HCN1比較P<0.05

3 討論

HCN通道廣泛分布于傷害性感覺傳導(dǎo)通路及 各級神經(jīng)元，如在中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)(vIPAG)，HCN2表達量最高，HCN1、HCN3及HCN4相對較少[15]；在DRG，HCN1及HCN2高表達，且HCN1主要分布于大中直徑神經(jīng)元細胞膜上，而HCN2表達在中小直徑神經(jīng)元細胞膜上，HCN3及HCN4的表達相對較少[16-17]等。脊髓背角是接受外周傷害性信息并向高級中樞傳遞的中繼站，也是調(diào)制傷害性信息傳遞的腦干下行抑制/易化系統(tǒng)投射纖維的終止部位，對傷害性信息的傳遞和調(diào)制起關(guān)鍵作用[5,18]。本研究以大鼠脊髓為研究對象，運用免疫組織化學(xué)方法和熒光定量PCR技術(shù)，探討了HCN通道4種亞型在正常和神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角的分布和表達情況。

組別術(shù)前術(shù)后1 d3 d7 d10 d14 dsham組75.3±3.774.9±1.676.6±4.372.1±1.072.0±2.273.8±2.8PSNL組74.9±3.654.3±2.7?51.8±2.7?44.6±2.0?44.6±0.8?48.1±0.9?

*與sham組比較P<0.05

組別HCN1HCN2HCN3HCN4sham組1.02±0.101.01±0.061.00±0.041.00±0.05PSNL組1.24±0.17 1.34±0.10?1.86±0.471.40±0.25

*與sham組比較P<0.05

目前關(guān)于HCN1～4在脊髓背角分布表達的研究存在爭議：例如，Tu等[7]發(fā)現(xiàn)HCN1在成年Wistar大鼠脊髓背角中僅存在于Ⅰ層、Ⅲ層和Ⅳ層，而在Ⅱ?qū)記]有表達，而Milligan等[8]發(fā)現(xiàn)HCH1主要表達在成年Wistar大鼠脊髓背角的Ⅲ層，在Ⅰ層和Ⅱ?qū)訋缀醪槐磉_。與大鼠的研究結(jié)果不同，在成年C57BL/6J小鼠中，HCN1被發(fā)現(xiàn)在Ⅰ層和Ⅱi～V層均有表達[9]。我們的免疫組化結(jié)果表明，成年SD大鼠的HCN1～4主要在脊髓灰質(zhì)中表達，白質(zhì)中幾乎不表達；其中HCN1在背角Ⅰ～Ⅵ各層均有分布，且以Ⅰ～Ⅱ?qū)訛橹?。以上研究的差異可能與實驗動物的種屬不同有關(guān)。本研究中的HCN2及HCN4的大體分布特點與之前報道基本一致，即它們在脊髓背角Ⅰ～Ⅵ層均有分布，其中以Ⅰ～Ⅱ?qū)颖磉_居多[7]。HCN3在脊髓背角的分布特點鮮見相關(guān)報道，我們發(fā)現(xiàn)其在脊髓背角的表達特點與其余3種亞型相似，即在Ⅰ～Ⅵ層具有表達，且以Ⅰ～Ⅱ?qū)幼疃唷Ｒ虼?，本研究首次闡明了HCN1～4 4種亞型在脊髓背角的表達特點。

脊髓背角的初級傷害性傳入纖維末梢的遞質(zhì)主要有2種，即肽類(P物質(zhì)和CGRP)和非肽類(IB4)。在小鼠脊髓背角，HCN1及HCN2與肽類的P物質(zhì)和CGRP有共染[9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)HCN1和HCN4與IB4存在共染，表明其在非肽類的初級神經(jīng)傳入纖維末梢也是有表達的。與Antal等[19]關(guān)于HCN2與IB4共染不明顯的結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)HCN2和HCN3與IB4幾乎不共染。此外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)HCN1、HCN2及HCN4多在胞膜或胞膜外區(qū)域表達，而HCN3主要在整個胞體表達。

目前檢測mRNA水平常用的方法有：原位雜交技術(shù)、常規(guī)PCR及熒光定量PCR法等。原位雜交技術(shù)可檢測mRNA的相對表達情況，但不能確定其絕對含量；常規(guī)PCR及熒光定量PCR都可定量分析mRNA的含量，不同點在于，前者是在PCR反應(yīng)結(jié)束后對產(chǎn)物進行定量分析，而后者可在PCR擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量分析，具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確及實時監(jiān)測等優(yōu)點[20]。我們的熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCN1～4 mRNA在大鼠脊髓背角均有表達，其中，HCN2具最高表達，HCN1次之，HCN3及HCN4表達量較少，這與Santoro等[21]應(yīng)用原位雜交技術(shù)在小鼠脊髓背角的研究結(jié)果相似，即表達量由高到低為HCN2、HCN1及HCN4，但其未研究HCN3的表達。本研究進一步明確了HCN通道1～4亞型mRNA在大鼠脊髓背角的表達特點。

神經(jīng)病理性疼痛以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和異常性疼痛等為特征，尚缺乏有效治療措施。神經(jīng)系統(tǒng)的異常興奮是產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的基礎(chǔ)，主要機制是外周及中樞敏化。研究表明，HCN通道在神經(jīng)病理性疼痛的起始及維持中發(fā)揮重要作用，如在vIPAG神經(jīng)元，CCI可增加HCN1和HCN2表達、Ih電流密度[22]；在DRG神經(jīng)元，mSNA(脊神經(jīng)損傷)不僅增加HCN2表達、Ih電流密度和激活速度，還可使受損的神經(jīng)纖維出現(xiàn)異位放電[23]；在脊髓背角，CCI可上調(diào)HCN1、HCN3及HCN4通道的表達[10]，奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛可上調(diào)HCN2的表達[1]；而HCN通道特異性阻斷劑(ZD7288)能明顯降低動物疼痛模型的神經(jīng)元異常放電頻率，同時緩解痛行為學(xué)[24]等。以上CCI、mSNA及奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛模型都可模擬人類神經(jīng)病理性疼痛的特點，但也存在不同點：如CCI模型可誘發(fā)很強的自發(fā)痛和冷痛敏，大約術(shù)后2周神經(jīng)損傷區(qū)域遠端的有髓鞘纖維幾乎全部脫髓鞘，常用于模擬臨床慢性神經(jīng)壓迫性損傷；mSNA模型表現(xiàn)為自發(fā)痛行為增加，有利于對比研究損傷和非損傷脊髓節(jié)段的初級傳入與疼痛的誘導(dǎo)和維持之間的機制關(guān)系，常用于模擬神經(jīng)叢和背根的損傷；奧沙利鉑是廣泛用于結(jié)直腸癌化療的關(guān)鍵藥物，常用于模擬臨床抗腫瘤藥物所致的周圍神經(jīng)病變。

此外，PSNL模型是一種常用的模擬外周神經(jīng)損傷后的燒灼樣痛的動物模型，具有痛相關(guān)行為(自發(fā)痛、機械痛和冷痛敏等)，出現(xiàn)早且持續(xù)時間長等優(yōu)點。不同神經(jīng)病理性疼痛模型的痛行為學(xué)特征不同，提示在痛覺傳導(dǎo)通路中某些通道的表達可能是不一樣的，因此，我們進一步探討了脊髓背角HCN通道在PSNL神經(jīng)病理性疼痛模型中的表達變化。與既往報道相似[14, 25]，本實驗中PSNL模型術(shù)后PWT顯著降低，表明我們的疼痛模型制備成功。我們進一步的研究發(fā)現(xiàn)PSNL可上調(diào)大鼠脊髓背角HCN2通道m(xù)RNA的表達，與奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛模型中脊髓HCN2 mRNA及蛋白表達上調(diào)的結(jié)果相似[1]，加之敲除HCN2基因可使神經(jīng)病理性疼痛的機械痛敏消失[26]，以上結(jié)果提示脊髓背角HCN2通道上調(diào)在PSNL誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛中具有關(guān)鍵作用。與楊舒蕾等[10]關(guān)于HCN1、HCN3及HCN4通道蛋白在CCI模型的脊髓背角表達上調(diào)的報道不同，本研究發(fā)現(xiàn)PSNL并不改變這3種HCN通道亞型的mRNA表達水平，這可能與疼痛模型種類及HCN通道的翻譯后調(diào)控的分子機制不同等原因相關(guān)，有待將來進一步研究。

綜上所述，本研究闡明了HCN通道4個亞型在大鼠脊髓背角分布特點以及其在PSNL模型中的表達變化，為今后HCN通道在神經(jīng)病理性疼痛方面的研究提供了理論依據(jù)，有助于深入研究HCN通道在脊髓背角的調(diào)控機制，對于臨床開展精準(zhǔn)藥物治療具重要意義。