劉丹, 鄧?yán)?2,鄭連姬,3, 鐘耕*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司，重慶，401121) 3(重慶市食品工業(yè)研究所，重慶，400020)

目前國(guó)內(nèi)外主要以NaH2PO4與Na2HPO4為酯化劑對(duì)多糖進(jìn)行酯化改性，引入了磷酸基團(tuán)，可改善其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)[4]。其主要采用濕法、干法、擠壓法。磷酸魔芋葡甘聚糖酯(konjac glucomannan phosphate ester, KGMP)的生產(chǎn)主要以濕法為主，此法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和，但取代度(degree of substitution, DS)不高，均低于0.06，且需使用大量昂貴的有機(jī)溶劑，受KGM水溶性的限制，對(duì)酯化反應(yīng)的規(guī)律性缺乏探討[5-6]；干法改性成本低，取代度高(0.08～0.17)， 但反應(yīng)不均勻，易產(chǎn)生其他副產(chǎn)物，工業(yè)生產(chǎn)時(shí)對(duì)設(shè)備要求較高[7-8]；擠壓法由于過(guò)高的壓力和過(guò)度的剪切使KGM黏度降得很低，不能滿足應(yīng)用要求。半干法反應(yīng)相中水分含量在20%～40%，具有節(jié)能、降耗、高效、無(wú)廢水排放等特點(diǎn)[9]。與傳統(tǒng)的加熱方式相比，微波具有加熱速度快、加熱時(shí)間短、加熱均勻等優(yōu)點(diǎn)，已作為新型能源廣泛用于化學(xué)改性中[10-11]。此外，杜先鋒等[12]研究表明在一定真空度下，物料內(nèi)水分?jǐn)U散速度加快，水分的擴(kuò)散有利于化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)真空處理技術(shù)形成的內(nèi)外壓差使得淀粉顆粒變得疏松，有利于氧化劑與淀粉充分混合。然而，真空輔助微波半干法用于KGMP的制備，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)根據(jù)前人的研究，從快速、節(jié)能、減排及降耗考慮，以KGM為原料，NaH2PO4與Na2HPO4混合鹽為酯化劑，采用真空輔助微波半干法制備KGMP，并通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酯化條件，為環(huán)境友好制備高取代KGMP提供理論與實(shí)際應(yīng)用的支撐，促進(jìn)KGMP作為抗老化劑在冷凍食品中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋粉(符合NY/T494—2010中普通魔芋微粉標(biāo)準(zhǔn))，重慶市康佳客有限公司；Na2HPO4(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；NaH2PO4(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；尿素(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZ600/2S 型真空包裝機(jī)，上海人民包裝股份有限公司；MAS-Ⅱ型微波快速制樣系統(tǒng)，上海新儀化學(xué)科技有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；YB-750A 型多功能粉碎機(jī)，浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司；NDJ-5S 型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，上海越平儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Spectrum 100 紅外光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魔芋葡甘聚糖磷酸酯(KGMP)真空輔助微波半干法制備方法

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的KGM，將NaH2PO4與Na2HPO4混合物(摩爾比2∶1)和尿素用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%(以KGM用量計(jì))的蒸餾水配制成磷酸鹽水溶液，用3 mol/L 的HCl和3 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)到合適的pH值，將所述懸濁液在攪拌條件下噴入到KGM微粉中，混合均勻，制得半干混合物，放入聚乙烯袋中，用真空包裝機(jī)真空處理一段時(shí)間，然后將樣品倒入燒杯中，置于微波反應(yīng)器中進(jìn)行微波加熱，反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)完畢的物料用體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇進(jìn)行數(shù)次洗滌，再用70%、80%、100%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，濾去洗液，將濾餅放入45 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干過(guò)夜，干燥后的物料經(jīng)粉碎過(guò)100目篩，即得到KGMP白色粉末。

1.3.2 取代度的測(cè)定

KGMP的取代度測(cè)定主要依據(jù)結(jié)合磷的含量[14]，結(jié)合磷的含量是由總磷減去游離磷的含量得到的。產(chǎn)物總磷含量采用GB5009.87—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中磷的測(cè)定》[15]方法進(jìn)行測(cè)定，游離磷測(cè)定采用HCl溶解試樣，蒸餾水多次洗滌后，過(guò)濾后取濾液，進(jìn)行鉬酸銨顯色反應(yīng)。由圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)磷曲線對(duì)應(yīng)出試樣中磷含量，從而求得取代度(DS)，DS按公式(1)計(jì)算[6]：

(1)

圖1 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Criterion curve of phosphorus content

1.3.3 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)主要考察微波反應(yīng)時(shí)間、微波反應(yīng)溫度、酯化劑與KGM摩爾比、真空處理時(shí)間、pH值、尿素用量對(duì)KGM取代度的影響，以方法1.3.1制備KGMP，以方法1.3.2測(cè)定其DS，以DS作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3.3.1 微波反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響

考察微波反應(yīng)時(shí)間分別為5、6、7、8、9、10 min時(shí)，對(duì)樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 5.0、真空處理時(shí)間30 s、反應(yīng)溫度90 ℃。

1.3.3.2 微波反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響

考察微波反應(yīng)溫度分別為70、80、90、100、110 ℃時(shí)，對(duì)樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 5.0、真空處理時(shí)間30 s、 反應(yīng)時(shí)間7 min。

1.3.3.3 酯化劑用量對(duì)取代度的影響

考察酯化劑與KGM摩爾比為0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1、1∶1時(shí)，對(duì)樣品取代度的影響。固定尿素用量6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 5.0、真空處理時(shí)間30 s、反應(yīng)溫度90 ℃、 反應(yīng)時(shí)間7 min。

1.3.3.4 真空處理時(shí)間對(duì)取代度的影響

考察真空處理時(shí)間分別為0、10、20、30、40 s時(shí)，對(duì)樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 5.0、反應(yīng)溫度90 4 ℃、反應(yīng)時(shí)間7 min。

1.3.3.5 pH值對(duì)取代度的影響

考察pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0時(shí)，對(duì)樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、真空處理時(shí)間30 s、反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間7 min。

1.3.3.6 尿素用量對(duì)取代度的影響

考察尿素用量分別為0%、2%、4%、6%、8%時(shí)，對(duì)樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 5.0、真空處理時(shí)間30 s、反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間7 min。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)KGMP取代度影響的分析，固定微波功率300 W，微波時(shí)間7 min，尿素用量6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。選取磷酸鹽用量、pH值、真空時(shí)間和微波反應(yīng)溫度為自變量(X)，各分3個(gè)水平，以取代度為響應(yīng)值(Y)，采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平取值Table 1 Coded levels of independent variables used in the RSM design

1.3.5 表觀黏度的測(cè)定

稱取1.0 g KGM和不同取代度的KGMP分散于99 mL蒸餾水中，在60 ℃水浴條件下溶脹1 h，冷卻至25 ℃，然后分別用NDJ-5型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)在25 ℃恒溫下測(cè)定溶液的表觀黏度。

1.3.6 透光率的測(cè)定

稱取一定質(zhì)量的KGMP配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液，60 ℃水浴條件下溶脹，冷卻至室溫25 ℃。以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描其透光率。

1.3.7 傅里葉紅外光譜的測(cè)定

采用KBr壓片法，以空氣作為對(duì)照，掃描波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描累加32次。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析處理方法

以上試驗(yàn)無(wú)特殊說(shuō)明，均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.0 軟件制圖，Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響

微波反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響如圖2所示，隨著微波反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物的取代度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，反應(yīng)物之間的碰撞幾率增加，酯化劑能夠充分地與KGM表面的羥基進(jìn)行反應(yīng)；當(dāng)微波時(shí)間為7 min時(shí)，取代度達(dá)到最大值，反應(yīng)7 min之后，取代度不斷降低，原因是KGM表面可及的羥基已經(jīng)與磷酸根發(fā)生了反應(yīng)，而過(guò)多的酯化劑無(wú)法接觸到活性羥基，并且長(zhǎng)時(shí)間高溫反應(yīng)使得KGM發(fā)生了熱降解或其他副反應(yīng)，從而導(dǎo)致取代度的降低，且產(chǎn)品出現(xiàn)發(fā)黃現(xiàn)象[16]。因此，微波反應(yīng)最佳時(shí)間為7 min。

圖2 微波反應(yīng)時(shí)間對(duì)DS的影響Fig.2 Effect of microwave reaction time on DS

2.1.2 微波反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響

如圖3所示，微波反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響較大，隨著微波反應(yīng)溫度的增加，產(chǎn)物的取代度先增加后降低。反應(yīng)溫度升高會(huì)促使KGM分子間的氫鍵斷裂，從而酯化劑與KGM分子的羥基充分接觸，有利于親核酯化反應(yīng)的進(jìn)行；此外，溫度的升高會(huì)使分子運(yùn)動(dòng)速率加快，使磷酸鹽試劑與分子的碰撞幾率增加，有利于磷酸基團(tuán)與羥基的結(jié)合，故取代度也相應(yīng)地增加[7]。反應(yīng)溫度在100 ℃以上，取代度降低，原因是溫度過(guò)高焦化嚴(yán)重，影響取代效率和產(chǎn)品質(zhì)量。所以微波反應(yīng)最佳溫度為100 ℃。

圖3 微波反應(yīng)溫度對(duì)DS的影響Fig.3 Effect of microwave reaction temperature on DS

2.1.3 酯化劑用量對(duì)取代度的影響

如圖4所示，磷酸鹽用量對(duì)取代度的影響很大。當(dāng)磷酸鹽與KGM的摩爾比低于0.7∶1時(shí)，加大磷酸鹽的用量，產(chǎn)物的取代度顯著增加。當(dāng)磷酸鹽與KGM的摩爾比高于0.7∶1時(shí)，磷酸鹽再增加，取代度的增加變得十分緩慢。這是因?yàn)镵GM分子上活性羥基基團(tuán)數(shù)目有限，低劑量的酯化劑范圍內(nèi)，取代度受磷酸鹽含量控制，高劑量范圍KGM酯化反應(yīng)所需的磷酸鹽以及達(dá)到飽和，磷酸鹽與KGM的摩爾比高于1∶1后，取代度并不會(huì)有較大的提高，只會(huì)增加產(chǎn)物中游離磷含量，導(dǎo)致產(chǎn)品顏色發(fā)黃，給后面的洗滌工序帶來(lái)困難[17]。故磷酸鹽與KGM摩爾比為0.7∶1為宜。

圖4 磷酸鹽與KGM的摩爾比對(duì)DS的影響Fig.4 Effect of molar ratio of phosphate and KGM on DS

2.1.4 真空處理時(shí)間對(duì)取代度的影響

如圖5所示，真空處理時(shí)間對(duì)取代度的影響較大。未真空處理時(shí)KGMP的取代度為0.138；當(dāng)真空處理10 s時(shí)，取代度顯著增加，為0.163；且隨著處理時(shí)間增加，取代度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵谝欢ǖ恼婵斩认绿幚鞬GM，產(chǎn)生的內(nèi)外壓差可使KGM顆粒結(jié)構(gòu)蓬松，KGM分子上的-OH充分暴露出來(lái)；另一方面，內(nèi)外壓差還會(huì)促使反應(yīng)相中反應(yīng)物彼此混合均勻，提高KGM酯化反應(yīng)效率[13]。真空處理時(shí)間太長(zhǎng)使混合物結(jié)塊，在微波加熱時(shí)易產(chǎn)生焦糊現(xiàn)象，故真空處理時(shí)間為30 s為宜。

圖5 真空處理時(shí)間對(duì)DS的影響Fig.5 Effect of vacuum treatment time on DS

2.1.5 pH值對(duì)取代度的影響

酯化反應(yīng)的過(guò)程中，適量的氫離子能夠促進(jìn)酯化反應(yīng)，pH低于3.0時(shí)，KGM會(huì)出現(xiàn)碳化的現(xiàn)象[18]。此外，pH在4.0～5.0，磷酸鹽的溶解度為20%～36%，當(dāng)pH大于6.0時(shí)，磷酸鹽的溶解度為13%[19]。故選取對(duì)pH值3.5～6.0進(jìn)行單因素試驗(yàn)。如圖6所示，隨著pH值的增加，取代度先增加后降低。當(dāng)pH值較低時(shí)，KGM適度降解，暴露出更多的活性羥基基團(tuán)，且分子間相互作用力減弱，有利于酯化反應(yīng)；當(dāng)pH值大于5.0后，磷酸鹽的溶解度降低，且其存在形式發(fā)生變化，導(dǎo)致DS下降。故pH值為5.0左右最佳。

圖6 pH值對(duì)DS的影響Fig.6 Effect of pH value on DS

2.1.6 尿素含量對(duì)取代度的影響

尿素作為催化劑，能夠促進(jìn)KGM分子中的葡萄糖、甘露糖殘基打開(kāi)氫鍵，游離出羥基，加快酯化反應(yīng)速度[6,20]。如圖7所示，隨著尿素含量的增加，取代度隨之增加，當(dāng)尿素含量達(dá)到6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))后，尿素自身與KGM發(fā)生反應(yīng)，從而與磷酸鹽之間競(jìng)爭(zhēng)羥基，取代度不再增加。因此尿素含量為6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為宜。

圖7 尿素含量對(duì)DS的影響Fig.7 Effect of urea content on DS

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

按照中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)定不同A：正磷酸鹽與魔芋葡甘聚糖的摩爾比、B：pH值、C：真空處理時(shí)間、D：微波溫度。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。多元回歸擬合所得取代度(DS)的二次多項(xiàng)回歸方程為公式(2)：

DS=0.20+0.000 333 3A-0.007 333B+0.001 333C-0.000 5D-0.026AB-0.004 75AC+0.006 75AD+0.023BC+0.001BD-0.005 75CD-0.012A2-0.053B2-0.013C2-0.014D2

(2)

表2 基于4因素3水平的響應(yīng)面分析中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Central composite design, experimental data for three-level-four-factor response surface analysis

續(xù)表2

序號(hào)n(磷酸鹽)∶n(KGM)pH值真空時(shí)間/s微波溫度/℃DS90.6∶15.030900.176100.8∶15.030900.163110.6∶15.0301100.169120.8∶15.0301100.183130.7∶14.5201000.161140.7∶15.5201000.100150.7∶14.5401000.120160.7∶15.5401000.151170.6∶15.0201000.171180.8∶15.0201000.180190.6∶15.0401000.181200.8∶15.0401000.171210.7∶14.530900.144220.7∶15.530900.130230.7∶14.5301100.134240.7∶15.5301100.124250.7∶15.0301000.195260.7∶15.0301000.202270.7∶15.0301000.208280.7∶15.0301000.193290.7∶15.0301000.205

由表3可以看出，模型的F值<0.000 1，是極顯著的，而失擬項(xiàng)P=0.878 2 >0.05，模型失擬度不顯著。這說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型的建立是高度顯著的，具有合理性。即可利用此回歸方程確定制備高取代的KGMP的最佳工藝。

通過(guò)軟件分析確定制備KGMP的最佳工藝，即磷酸鹽與KGM摩爾比為0.72∶1、pH值4.93、真空處理時(shí)間28.65 s、微波溫度100.55 ℃，此條件下由公式算出的KGMP取代度理論值為0.201。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)條件為磷酸鹽與KGM摩爾比為0.72∶1、pH值5.0、真空處理時(shí)間29 s、微波溫度100 ℃，KGMP的DS為0.199，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

2.3 表觀黏度

圖8顯示，未改性的KGM黏度達(dá)到39 417 mPa·s，而改性后KGMP黏度均有所下降，且隨著取代度的增加，黏度逐漸降低，當(dāng)取代度為0.199時(shí)，KGMP的黏度下降到11 516 mPa·s。這是由于在反應(yīng)過(guò)程中，酸和高溫的作用下，使得KGM分子鏈發(fā)生部分?jǐn)嗔?，降低其分子質(zhì)量。與SITOHY等[21]在制備磷酸酯淀粉時(shí)結(jié)果類似。

表3 方差分析及相關(guān)統(tǒng)計(jì)參數(shù)結(jié)果Table 3 Result of analysis of variance (ANOVA) for quadratic model using DS as response

注：**為差異極顯著(P<0.01)；*為差異顯著(P<0.05)。

圖8 不同取代度KGMP的黏度Fig.8 Viscosity of KGMP with different substitution degrees

2.4 透光率

如圖9所示，在200～800 nm，與KGM相比，KGMP的透光率增加；隨著取代度的增加，KGMP的透光率增加。這是因?yàn)閹ж?fù)電荷的磷酸基團(tuán)引起的相鄰KGMP分子之間產(chǎn)生排斥作用，降低鏈間締合，增加了水與KGMP相互作用，形成具有高透光率的膠液[22]。

圖9 不同取代度KGMP的透光率Fig.9 Transmittance of KGMP with different substitution degrees

2.5 傅里葉紅外光譜分析

圖10 KGM和KGMP的紅外光譜圖Fig.10 FTIR patterns of KGM and KGMP

3 結(jié)論

以NaH2PO4與Na2HPO4混合鹽為酯化劑對(duì)KGM進(jìn)行改性，通過(guò)真空輔助微波半干法獲得了高取代度KGMP。短時(shí)真空處理能夠顯著提高產(chǎn)品的DS；微波加熱速度快、加熱時(shí)間短、加熱均勻，反應(yīng)只需7 min就能制備高取代度的KGMP。真空輔助微波半干法制備KGMP減少了酯化劑流失，同時(shí)縮短反應(yīng)時(shí)間，能夠達(dá)到高效、節(jié)能、減排、降耗的效果。

真空輔助微波半干改性的最佳工藝條件:微波時(shí)間7 min、微波溫度100 ℃、磷酸鹽與KGM摩爾比為0.72∶1、真空處理時(shí)間29 s、pH值5.0、尿素用量6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，在此條件下KGMP的取代度為0.199。隨著取代度的增加，KGMP的表觀黏度降低，透光率增加。紅外光譜表明KGM分子上成功引入磷酸基團(tuán)。