于嬌，陳勝軍，胡曉，楊少玲，楊賢慶，李來好，吳燕燕

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510300)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

壇紫菜(Porphyrahaitanensis)，系暖溫帶性種類[1]，主要分布在福建、浙江和廣東沿岸，是我國(guó)特有的原始大型經(jīng)濟(jì)海藻[2-3]。紫菜蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，其總氨基酸含量高于滸苔、石莼、裙帶菜、龍須菜、海帶、馬尾藻和麒麟藻[4]，含8種必需氨基酸，富含天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、精氨酸和賴氨酸，可彌補(bǔ)谷物蛋白中賴氨酸含量較低的缺陷。中國(guó)是世界紫菜的主要生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，2016年養(yǎng)殖面積達(dá)73千公頃，年產(chǎn)量高達(dá)13.5萬t[5]，其中壇紫菜占我國(guó)紫菜總產(chǎn)量的50%以上[2]，具有巨大的碳匯潛力[6]和經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值。同時(shí)，隨著陸地蛋白質(zhì)資源的日益匱乏，海洋藻類作為新型蛋白質(zhì)資源的來源已逐漸受到重視，充分利用壇紫菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，滿足人們對(duì)于高品質(zhì)蛋白質(zhì)的需求，為提高海洋資源開發(fā)能力和發(fā)展海洋經(jīng)濟(jì)提供一條可行之路。

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，新型提取方法如超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和液氮研磨法被應(yīng)用到蛋白質(zhì)的提取過程中，具有設(shè)備簡(jiǎn)單，安全環(huán)保，無化學(xué)殘留，耗時(shí)短，效率高等優(yōu)勢(shì)[7-8]。超聲波輔助提取法(ultrasonic-assisted extraction，UAE)通過在生物基質(zhì)中產(chǎn)生熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)破碎植物組織細(xì)胞壁[9]，已被廣泛應(yīng)用到蛋白質(zhì)[10]、多糖[11]、多酚[12]、油脂[13]和黃酮類化合物[14]的提取制備。但目前對(duì)于紫菜水溶性蛋白質(zhì)的提取、基礎(chǔ)特性研究較少，多數(shù)研究中原料局限于條斑紫菜且提取率普遍低于50%[15-16]，而且不同種類的紫菜蛋白在含量、組成等特性上存在一定差異，因此研究壇紫菜蛋白的提取、基礎(chǔ)特性十分必要。2012年，姚興存等[16]采用超聲波提取條斑紫菜蛋白，在超聲時(shí)間10 min、溫度50 ℃、料液比10∶1(mg∶mL)條件下提取率為37.6%。 紫菜的采收期一般可分為4次，即頭水、二水、三水和四水，一般越往后營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)越低，三水和四水等相對(duì)低值的壇紫菜資源是總產(chǎn)量的主要組成部分，一般較少用于食用[17]。本研究以廣東南澳產(chǎn)三水壇紫菜為原料，優(yōu)化超聲波結(jié)合水提酸沉法提取壇紫菜蛋白工藝條件，并對(duì)其基礎(chǔ)特性進(jìn)行測(cè)定，旨在為低值壇紫菜的精深加工提供一定科學(xué)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

第三次采收期壇紫菜，收獲于廣東省南澳汕頭市澄海區(qū)培隆紫菜養(yǎng)殖區(qū)，在50 ℃烘干至質(zhì)量恒定，過100目篩，干燥保存。凱氏定氮法測(cè)得其蛋白質(zhì)含量為34%。

0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃H2SO4、0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液、K2SO4、H3BO3、CuSO4，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec TM 2300型蛋白自動(dòng)分析儀，丹麥Foss公司；BioTek全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；JY 99LLDN超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；日立835-50型高速氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司；TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；Delta320精密pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

準(zhǔn)確稱取1 g紫菜粉，加入100 mL蒸餾水混合均勻，設(shè)置一定的超聲功率，設(shè)置頻率參數(shù)為20 kHz，變幅桿25 mm，超聲一定時(shí)間，4 500 r/min離心10 min， 將上清液pH調(diào)至等電點(diǎn)4.2，靜置1 h，4 500 r/min離心10 min，收集粗蛋白并真空冷凍干燥24 h。壇紫菜蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[18]，提取率計(jì)算見公式(1)。

(1)

式中：m1，粗蛋白中蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m0，樣品原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)SPSS 20.0軟件，采用單因素方差分析法(ANOVE，Tukey檢驗(yàn))進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并通過Dunbcan’s法進(jìn)行單因素多重比較分析，以獲得影響蛋白提取率的顯著性因素。本實(shí)驗(yàn)分別考察了料液比(5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1(mg∶mL))、功率(720、900、1 080、1 260、1 440 W)、超聲發(fā)出時(shí)間(2、4、6、8、10 s)和超聲全程時(shí)間(15、30、45、60、75 min)對(duì)壇紫菜蛋白提取率的影響。由于超聲發(fā)生時(shí)間高于超聲間歇時(shí)間時(shí)，提取液局部易形成高溫、高壓，易導(dǎo)致蛋白變性，因此本實(shí)驗(yàn)采用相同的超聲發(fā)生時(shí)間和超聲間歇時(shí)間。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)工藝優(yōu)化

依據(jù)Design Expert 8.0.5 Trial軟件，采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面(response surface methodology，RSM)試驗(yàn)優(yōu)化關(guān)鍵因素，以獲得紫菜蛋白的最佳提取工藝條件。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以功率(A)、超聲發(fā)出時(shí)間(B)、超聲全程時(shí)間(C)3個(gè)關(guān)鍵因素為自變量，以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，共設(shè)立17個(gè)處理組。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Response surface test factor levelTable

1.3.4 等電點(diǎn)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2 g壇紫菜蛋白，溶于200 mL去離子水中，取上清液20 mL并分別調(diào)至pH值為3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，靜置1 h，4 500 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入3 mL考馬斯亮藍(lán)(G-250)試劑，混勻并-靜置10 min，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，壇紫菜蛋白的等電點(diǎn)(isoelectric point，pI) 為吸光度值最低點(diǎn)[19]。

1.3.5 紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定

配制5 mg/mL的蛋白溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在200～700 nm進(jìn)行掃描測(cè)定。

1.3.6 氨基酸分析

色氨酸參考GB/T 18246—2000[20]法，其他氨基酸則參考GB/T 5009.124—2016[21]法。

根據(jù)1973年FAO/WHO提出的每克氮氨基酸評(píng)分模式和中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所提出的雞蛋蛋白氨基酸評(píng)分模式對(duì)比分析[22-23]。氨基酸評(píng)分(amino acid score，AAS)和化學(xué)評(píng)分(chemical score，CS)的計(jì)算見公式(3)和(4)。

(3)

(4)

(5)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析

2.1.1 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可知，蛋白質(zhì)的提取率隨著料液比的增加先上升后下降，在 10∶1 (mg∶mL)時(shí)提取率達(dá)到最大，且各處理組無顯著差異(P>0.05)；這是因?yàn)槿芤旱酿ざ容^低，分子擴(kuò)散速率較高，傳質(zhì)推動(dòng)力越大，提取率上升；隨著料液比的增加，細(xì)胞內(nèi)容物的大量溶出使得溶液的黏度較高，體系分散不均勻，影響了蛋白質(zhì)的溶出量，因而提取率下降。綜合考慮，料液比選擇10∶1 (mg∶mL)較為合適。

圖1 料液比蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction yield of protein

2.1.2 功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，蛋白質(zhì)的提取率隨著功率的增加先迅速上升后緩慢上升，在超聲功率1 440 W時(shí)達(dá)到最大，各處理組存在顯著差異(P<0.05)；這是因?yàn)榭栈?yīng)和機(jī)械效應(yīng)的增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子與水分子之間相互作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解[24]，因此提取率迅速上升；隨著功率的增加，由于超聲產(chǎn)生的大量微氣泡無法達(dá)到完全潰陷造成空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)的減弱，因此提取率上升緩慢?？紤]到生產(chǎn)成本和儀器使用壽命，超聲波功率選擇1 080～1 440 W較為合適。

圖2 功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of power on the extraction yield of protein

2.1.3 超聲發(fā)出時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，蛋白質(zhì)的提取率隨著超聲發(fā)出時(shí)間的增加先緩慢上升后迅速下降，在超聲發(fā)出時(shí)間6s時(shí)達(dá)到最大，且處理組存在顯著差異(P<0.05)；這是因?yàn)槌掷m(xù)的超聲促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用，有利于蛋白質(zhì)的溶出，因此提取率增加；隨著超聲發(fā)出時(shí)間的增加，超聲局部產(chǎn)生的熱效應(yīng)使得蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級(jí)鍵被破壞，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子間相互結(jié)合而形成沉淀[25]，不利于蛋白質(zhì)的溶出，且超聲探頭工作時(shí)間過長(zhǎng)影響其使用壽命。綜合考慮，超聲發(fā)出時(shí)間選擇4～8 s較為合適。

圖3 超聲發(fā)出時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasound emit time on the extraction yield of protein

2.1.4 超聲全程時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知，蛋白質(zhì)的提取率隨著超聲全程時(shí)間的增加先迅速上升后迅速下降，在超聲全程時(shí)間達(dá)到45 min時(shí)達(dá)到最大，且處理組存在顯著差異(P<0.05)； 這是因?yàn)槌暡ㄔ鰪?qiáng)了水分子配位能力，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子和水分子的交互作用，因此提取率上升；隨著超聲全程時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)疏水集團(tuán)暴露而巰基被掩埋在分子內(nèi)部，通過非共價(jià)鍵形成了蛋白質(zhì)聚集體，因此蛋白質(zhì)提取率下降[26]。綜合考慮，超聲全程時(shí)間選擇30～60 min較為合適。

圖4 超聲全程時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasound full time on the extraction yield of protein

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性分析

經(jīng)Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行分析，得到紫菜蛋白提取率的二次回歸模型：Y/%= 61.17+0.91A+0.58B+3.53C-0.01AB-0.06AC+1.02BC-4.63A2-2.89B2-3.86C2

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimenal design and correspongding results for respond surface analysis

由A、B、C的F值大小可以推斷出，3個(gè)因素對(duì)壇紫菜蛋白提取率影響主次順序?yàn)镃>A>B。由表2可知，平行試驗(yàn)中數(shù)據(jù)存在一定的波動(dòng)性，這可能是由于變幅桿的超聲探頭作為一種耗材，長(zhǎng)時(shí)間的工作模式會(huì)使其變幅桿探頭逐漸磨損，超聲效果變差，因此認(rèn)為不同磨損程度上的超聲探頭發(fā)出超聲的強(qiáng)度略有差異。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

注：**，P<0.01,差異極顯著；*，P<0.05，差異顯著。

2.2.2 因素間交互作用影響結(jié)果

經(jīng)過Design-Expert 8.0.5軟件處理，得到功率(A)、超聲發(fā)生時(shí)間(B)、超聲全程時(shí)間(C)交互作用的響應(yīng)面和等高線圖。如圖5～圖7所示，超聲全程時(shí)間和超聲發(fā)生時(shí)間(BC)對(duì)壇紫菜蛋白提取率的影響顯著，功率和超聲發(fā)出時(shí)間(AB)、功率和超聲全程時(shí)間(AC)交互作用不顯著，與顯著性分析結(jié)果相符。

根據(jù)所得到的響應(yīng)面模型，經(jīng)Design-Expert 8.0.5軟件處理得到最優(yōu)工藝為功率1 276.73 W、超聲發(fā)生時(shí)間6.37 s、超聲全程時(shí)間52.22 min，在此條件下壇紫菜蛋白提取率為62.12%?？紤]到實(shí)際可操作性，調(diào)整工藝參數(shù)為功率1 278 W、超聲發(fā)生時(shí)間6 s、超聲全程時(shí)間52 min，在此條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，壇紫菜蛋白提取率為61.13%、60.96%、61.50%，取平均值為61.20%，與理論值較為接近，表明響應(yīng)面模型對(duì)優(yōu)化壇紫菜蛋白的提取工藝可行。

圖5 功率和超聲發(fā)出時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of interactions between power andultrasonic emission time

圖6 功率和超聲全程時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of interactions between power and ultrasound full tme

圖7 超聲發(fā)出時(shí)間和超聲全程時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of interactions between ultrasonic emission time and ultrasonic full time

2.3 壇紫菜蛋白基礎(chǔ)特性分析

2.3.1 等電點(diǎn)分析

由圖8可知，pH值在3.4～5.0變化時(shí)，樣品上清液吸光度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在pH 4.2時(shí)吸光度最低，上清液中蛋白溶解度最小，即壇紫菜蛋白的等電點(diǎn)pI為4.2；這是因?yàn)閜H靠近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)無序聚集，溶解度部分喪失或全部喪失[27]。

圖8 蛋白等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果Fig.8 Isoelectric point of the protein

2.3.2 紫外光譜分析

大部分氨基酸在紫外區(qū)僅有一個(gè)吸收峰，吸收峰多集中在200～220 nm，而Phe的吸收峰在222 nm 與259 nm，Tyr的吸收峰在231 nm及272 nm，Trp的吸收峰在227 nm與279 nm[28]。由圖9可知，在200～700 nm對(duì)蛋白溶液進(jìn)行紫外-可見光譜掃描時(shí)，220～280 nm曲線吸收較高，在260 nm 出現(xiàn)最大吸收峰，且未見明顯雜峰；這是因?yàn)閴喜说鞍踪|(zhì)氨基酸組成種類較多，Phe含量高于Tyr和Trp，因此最大吸收峰靠近Phe的最大吸收峰波長(zhǎng)為259 nm。

圖9 蛋白溶液紫外-可見光譜掃描Fig.9 UV-visible spectrum of the protein solution

2.3.3 氨基酸組成分析

由表4可知，檢測(cè)到壇紫菜蛋白中共17種氨基酸(半胱氨酸未檢測(cè))，種類齊全，Glu、Asp和Ala含量最高，必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.29%，非必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.71%，必需氨基酸和非必需氨基酸的比例為0.675，高于世界衛(wèi)生組織規(guī)定值0.666，表明壇紫菜蛋白氨基酸組成合理[29]。僅根據(jù)必需氨基酸與非必需氨基酸的比例無法完全評(píng)估壇紫菜蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[30]，因此采用FAO/WHO聯(lián)合推薦的必需氨基酸模式和雞蛋蛋白模式評(píng)估蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由表5可知，壇紫菜蛋白中Val、Lys、Leu、Thr和Phe+Tyr高于FAO/WHO氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式；Val、Leu、Thr和Phe+Tyr高于雞蛋蛋白氨基酸模式，表明壇紫菜蛋白氨基酸組成與人體需求模式基本平衡，是一種理想蛋白源。Met的必需氨基酸評(píng)分(AAS)和化學(xué)評(píng)分(CS)評(píng)分最低，是第一限制性氨基酸。壇紫菜蛋白質(zhì)的氨基酸組成比例與EUN-SUN等[31]測(cè)定結(jié)果相比，氨基酸組成較為相似，但氨基酸占總氨基酸含量比例卻不同，這可能與紫菜的品種、生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)季節(jié)有關(guān)。

表4 壇紫菜蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid of composition of Algal protein

注：E為必需氨基酸總和；N為非必需氨基酸總和。

表5 蛋白模式及必需氨基酸分析Table 5 Protein mode and essential amino acid analysis

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用三水紫菜作為原料，采用UAE進(jìn)行壇紫菜蛋白的制備，運(yùn)用單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面模型進(jìn)行壇紫菜蛋白工藝的優(yōu)化，同時(shí)對(duì)壇紫菜蛋白基礎(chǔ)特性進(jìn)行研究，旨在為低值壇紫菜的精深加工提供一定理論依據(jù)。通過3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，壇紫菜蛋白最佳提取工藝為超聲功率為1 278 W、超聲發(fā)出時(shí)間為6 s、超聲全程時(shí)間為52 min，得率最高為61.20%，同時(shí)測(cè)定了壇紫菜蛋白的等電點(diǎn)、紫外最大吸收波長(zhǎng)和氨基酸種類與含量，本研究為低值壇紫菜的研究開發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)和理論支持。