朱強(qiáng)，王瑞鑫，吳鋮迪，夏艷秋*

1 (江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港，222005) 2 (淮海工學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港，222005)

生料釀酒采用無蒸煮技術(shù)，可節(jié)約總能耗的30%～40%，是釀酒業(yè)實(shí)施節(jié)能降耗的重要舉措[1-2]，已引起人們的廣泛關(guān)注[3-7]，必將帶來釀酒業(yè)的顛覆性變革。生淀粉糖化酶(raw starch-digesting glucoamylase,RSGA)無疑是實(shí)現(xiàn)生料釀酒的先決條件也是關(guān)鍵技術(shù)[8-9]?，F(xiàn)行的生淀粉糖化酶主要由微生物產(chǎn)生[9-26]，而適用于生料釀酒的生淀粉糖化酶源只有霉菌，目前已報(bào)道的主要有曲霉[16-21]、根霉[22-23]和青霉[24-26]，然而在其制曲工藝中，由于多采用恒溫培養(yǎng)，未遵循微生物生長(zhǎng)代謝規(guī)律，未重視促酵劑的使用，對(duì)生產(chǎn)實(shí)際考慮不周等，導(dǎo)致制曲周期長(zhǎng)、成曲酶活力低，嚴(yán)重阻礙其推廣應(yīng)用。黑曲霉SP7-2為課題組通過自然分離結(jié)合誘變育種選育獲得的酒用生淀粉糖化酶優(yōu)良菌株[20]，其生淀粉糖化酶活力高、復(fù)合酶系協(xié)同作用強(qiáng)，初步用于黃酒生料釀造顯示出一定的優(yōu)越性，有望成為生料釀酒的重要生產(chǎn)菌株。試驗(yàn)擬通過固態(tài)發(fā)酵技術(shù)探索黑曲霉SP7-2產(chǎn)酶優(yōu)化工藝，并研究其放大生產(chǎn)性能，旨在為實(shí)現(xiàn)對(duì)生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌生理特征和生料曲制備的深入研究，并進(jìn)一步推動(dòng)對(duì)現(xiàn)行生料釀酒工藝體系的技術(shù)升級(jí)和改造以提供試驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉(Aspergillus.niger)SP7-2：課題組選育，本研究室保藏。

麩皮：市售，當(dāng)年新鮮小麥麩皮，水分12.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，40～60目。

1.2 方法

1.2.1 種曲制備

麩皮∶水=1∶1.2(g∶mL)配料，添加適量營(yíng)養(yǎng)鹽，拌勻，潤(rùn)料2 h，121 ℃濕熱滅菌40 min，冷卻至30 ℃，按麩皮質(zhì)量10%接種SP7-2單孢子懸浮液(懸浮液孢子密度1.0×108CFU/mL)，32 ℃培養(yǎng)3 d左右，38～40 ℃ 熱風(fēng)烘干。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)條件[20]

250 mL三角瓶裝10 g麩皮，料水比1∶1.2(g∶mL)，pH自然，拌勻，潤(rùn)料，滅菌，冷卻，按麩皮質(zhì)量0.3%接種SP7-2種曲(種曲孢子密度1×1010CFU/g)，180 r/min、32 ℃培養(yǎng)3 d，烘干。

1.2.3 生淀粉糖化酶活力測(cè)定[15]

發(fā)酵結(jié)束，三角瓶固體培養(yǎng)物中加入100 mL蒸餾水，40 ℃水浴振蕩浸提1 h，過濾得粗酶液。5 mL離心管中分別加入1 mL底物(用0.1 mol/L、pH 4.6的醋酸緩沖液新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%生玉米淀粉懸浮液)、1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，40 ℃、180 r/min水浴振蕩反應(yīng)1 h，加入2 mol/L NaOH溶液0.1 mL終止反應(yīng)，反應(yīng)液5 000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)定還原糖的量。定義：在上述分析條件下，1 min水解生淀粉產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計(jì))的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 工藝優(yōu)化

試驗(yàn)比較碳、氮源，水分，促酵劑(植酸)，pH值，溫度，通風(fēng)等因素對(duì)SP7-2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，優(yōu)化其產(chǎn)酶工藝條件。

1.2.5 放大試驗(yàn)

30 L固態(tài)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)65%，按照1.2.4優(yōu)化工藝參數(shù)固態(tài)發(fā)酵，探討30L固態(tài)發(fā)酵罐中SP7-2生長(zhǎng)繁殖與代謝產(chǎn)酶規(guī)律，確定發(fā)酵終點(diǎn)，并適當(dāng)調(diào)整工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適培養(yǎng)基質(zhì)的確定

表1表明，培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)SP7-2菌株生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶的影響較大，其中，最適宜的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)是麩皮，其次是大米和小麥。考慮到經(jīng)濟(jì)因素，不宜采用大米和小麥。因此，后續(xù)試驗(yàn)均采用麩皮為SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)RSGA基質(zhì)。

表1 培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)SP7-2固態(tài)發(fā)酵的影響Table 1 Effects of different matrixes on SP7-2 by SSF

2.2 最適料水比的確定

由表2可知，料水比對(duì)SP7-2菌株生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶的影響是顯著的。在一定范圍內(nèi)，隨料水比的增加，酶活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，而孢子數(shù)卻呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。當(dāng)料水比較低時(shí)，營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)慢且不發(fā)達(dá)，培養(yǎng)物中心含有明顯的未被消耗的淀粉顆粒，酶活力及孢子數(shù)均較低。而料水比過高時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)菌絲前期生長(zhǎng)快，使得培養(yǎng)物中心易積聚高溫，出現(xiàn)爛心和表面凝結(jié)水現(xiàn)象，從而促進(jìn)氣生菌絲及分生孢子產(chǎn)生，導(dǎo)致酶活力急劇下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)RSGA料水比為1∶1.1(g∶mL)，制備種子料水比為1∶1.2(g∶mL)。

表2 料水比對(duì)SP7-2固態(tài)發(fā)酵的影響Table 2 Effects of different water cotents on SP7-2 by SSF

2.3 復(fù)配氮源的確定

由表3可以看出，復(fù)配氮源可提高SP7-2菌株RSGA的活力，且有機(jī)氮優(yōu)于無機(jī)氮，豆餅粉優(yōu)于蛋白胨。(NH4)2SO4作為復(fù)配氮源，孢子數(shù)得到較大提高。

表3 復(fù)配氮源對(duì)SP7-2固態(tài)發(fā)酵的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on SP7-2 by SSF

因此，SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)RSGA時(shí)可適當(dāng)配比20%～30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))豆餅粉，以提高酶活力。制備種子時(shí)，則可以酌情補(bǔ)充0.2%～1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(NH4)2SO4，以提高孢子數(shù)。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以麩皮∶豆餅粉=1∶0.2(g∶g)，料水比1∶1.1(g∶mL)，按表4因素水平設(shè)計(jì)L934正交試驗(yàn)，考察SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)RSGA優(yōu)化的工藝條件，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表4和表5。

表4 L934影響因子正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果Table 4 Factors, levels and results of L934 multi-analysis test

注：雙控溫指前期10～12 h，恒溫32 ℃；中期至培養(yǎng)結(jié)束，恒溫35 ℃。

表5 L934影響因子正交試驗(yàn)方差分析Table 5 Analysis of variance of L934 multi-analysis test

注：*代表差異顯著，P<0.01。

由表4直觀分析可知，SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)RSGA工藝條件中，培養(yǎng)溫度影響最大(方差分析顯示影響顯著，見表5)，其次為翻拋間隔及植酸用量，初始pH影響最小，正交試驗(yàn)所得優(yōu)化工藝條件為：采取雙控溫培養(yǎng)、每24 h翻拋1次，添加0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))植酸，初始pH 5.0。以此優(yōu)化工藝固態(tài)培養(yǎng)所得RSGA平均值為5594 U/g。

2.5 發(fā)酵終點(diǎn)的確定(30 L固態(tài)發(fā)酵罐)

由圖1可明顯看出，SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵過程可分為3個(gè)特征階段：孢子萌發(fā)(0～12 h)、菌絲生長(zhǎng)繁殖(12～60 h)、產(chǎn)孢子(60～120 h)。在此生長(zhǎng)規(guī)律下，RSGA活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在培養(yǎng)至60 h時(shí)，酶活力最高，為7 870 U/g。隨著孢子的大量生成，酶活力則急劇下降。據(jù)此，確定SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)RSGA的發(fā)酵終點(diǎn)為60 h。若制備種子，則培養(yǎng)至120 h較佳。

圖1 SP7-2固態(tài)發(fā)酵孢子及酶活力曲線Fig. 1 Spore and RSGA activity curve of SP7-2 by SSF

3 結(jié)論和討論

溫度通過影響微生物體內(nèi)酶的表達(dá)與分泌，從而影響微生物生長(zhǎng)與代謝。由于不同種類微生物生長(zhǎng)繁殖所需溫度不同，即使同一種微生物在不同的生理時(shí)期、對(duì)于不同的代謝產(chǎn)物所需溫度亦不同。因此，探索適宜的培養(yǎng)溫度是微生物培養(yǎng)過程中最重要的工作。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SP7-2菌株孢子萌發(fā)最適溫度32 ℃，菌絲生長(zhǎng)最適溫度35 ℃，孢子形成最適溫度37 ℃，與SP7-2菌株生長(zhǎng)規(guī)律的階段性特征高度相似。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨著菌絲的生長(zhǎng)繁殖，SP7-2產(chǎn)RSGA活力亦大幅增加，RSGA活力上升與菌絲生長(zhǎng)繁殖回歸方程為y=1 033.4x-1 656.6(R2= 0.822 6，12～60 h，菌絲生長(zhǎng)繁殖期，x為孢子數(shù)，y為RSGA活力)，呈現(xiàn)顯著線性關(guān)系。

特別值得一提的是，SP7-2菌株菌絲生長(zhǎng)到頂囊即將形成時(shí)RSGA活力最高。伴隨著氣生孢子的大量產(chǎn)生，RSGA活力則急劇下降，RSGA活力下降與孢子生成回歸方程為y=-50.713x+ 7 742.5(R2= 0.912 2，60～120 h，產(chǎn)孢子期，x為孢子數(shù)，y為RSGA活力)，呈現(xiàn)極顯著線性關(guān)系。據(jù)此，判斷營(yíng)養(yǎng)菌絲是RSGA的主要來源，氣生菌絲或分生孢子梗RSGA活力甚低或根本沒有。此判據(jù)可作為工業(yè)制曲過程中RSGA活力在線檢測(cè)分析的重要形態(tài)指標(biāo)，從而免去了繁瑣的理化指標(biāo)測(cè)定。

以上動(dòng)力學(xué)特征分析表明，RSGA屬偶聯(lián)型產(chǎn)物，其與SP7-2菌株的菌絲生長(zhǎng)是同步的。因此，可通過提高SP7-2菌絲生長(zhǎng)速度或增加菌體濃度來提高產(chǎn)量。據(jù)此，試驗(yàn)采取階段式雙控溫培養(yǎng)：前期0～12 h恒溫32 ℃促進(jìn)孢子萌發(fā)，中期12～60 h升溫至35 ℃間歇翻拋，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)及酶的積累，一旦菌絲頂囊即將形成(約60 h)，立刻升溫至40 ℃熱風(fēng)烘干。結(jié)果表明，采用此雙控溫培養(yǎng)，可顯著提高RSGA活力，并能大大縮短產(chǎn)酶周期，且鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲柄比恒溫培養(yǎng)的粗短。

麩皮約含20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))淀粉，還富含礦物質(zhì)和維生素等生長(zhǎng)因子，不僅為微生物生長(zhǎng)繁殖提供必需的營(yíng)養(yǎng)素，還可作為緩沖成分或促酵劑等維持適宜的生理pH范圍或提高酶活力。麩皮疏松透氣，作為主要固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，結(jié)合適時(shí)翻拋，可為好氧菌的旺盛繁殖提供足夠的氧氣，是SP7-2菌株生長(zhǎng)繁殖及發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)良基質(zhì)，可單獨(dú)使用或適當(dāng)追加氮源等營(yíng)養(yǎng)。由于麩皮(或與豆餅粉的混合物)自身pH為5.0～6.0， 實(shí)際固態(tài)發(fā)酵過程中，可采取自然pH，從而簡(jiǎn)化制曲工藝。

特別值得關(guān)注的是，在培養(yǎng)基中添加微量的植酸可大大提高SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵RSGA產(chǎn)量與活力。植酸是一種表面活性劑，其促進(jìn)酶產(chǎn)量與活力增加的原因主要是通過提高菌絲細(xì)胞膜通透性，從而提高氧的傳遞速度及基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)供給與細(xì)胞的吸收，進(jìn)而提高微生物酶的表達(dá)與分泌[27]。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植酸作為促酵劑可顯著提高黃曲霉糖化酶活力[28]，用于黑曲霉SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)RSGA亦顯示積極效應(yīng)。

綜上，試驗(yàn)確定SP7-2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)RSGA優(yōu)化工藝為：麩皮為基質(zhì)，復(fù)配20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))豆餅粉，料水比1∶1.1(g∶mL)，添加0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))植酸，初始pH自然，每24 h翻拋1次，采取雙控溫培養(yǎng)60 h。在此優(yōu)化工藝條件下，30 L固態(tài)發(fā)酵罐中RSGA活力為7 870 U/g，是優(yōu)化前的1.31倍。

黑曲霉SP7-2產(chǎn)RSGA活力的提高無疑給生料釀酒業(yè)又提供了一個(gè)重要的酶源，然而，其用于生料釀酒還需解決諸多如多菌種協(xié)調(diào)配比、用量、溫控、后處理等重要技術(shù)問題。因此，繼續(xù)采用高新技術(shù)研究SP7-2菌株生料曲的制備，探索其生料釀酒工藝對(duì)推動(dòng)生料釀酒業(yè)的快速高質(zhì)發(fā)展有重大的現(xiàn)實(shí)意義。