楊亞楠，宿玲恰，吳敬*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

麥芽四糖淀粉酶具有外切酶活性，屬于GH13家族的淀粉水解酶類，從淀粉的非還原末端，特異的依次切割第4個α-1,4糖苷鍵，生成以麥芽四糖為主的麥芽低聚糖。麥芽四糖是由4個α-D型葡萄糖基以α-1,4糖苷鍵連接成的直鏈麥芽低聚糖，是一種功能性食品，其甜度低、黏度高、保濕性好，具有易消化吸收、低滲透壓等特點(diǎn)和抑制腸內(nèi)腐敗菌、保持腸道健康、促進(jìn)人體對Ca2+吸收等功能，主要應(yīng)用于食品與醫(yī)療領(lǐng)域。

1971年，ROBYT和ACKERMAN首次報道了PseudomonasstutzeriNRRL B-3389來源的麥芽四糖淀粉酶[1]，此后相繼在PseudomonassaccharophilaIAM1504[7]、PseudomonasstutzeriMO-19[2]、Pseudomonassp.IMD 353[5]、PseudomonasstutzeriAS22[6]等菌株中發(fā)現(xiàn)麥芽四糖淀粉酶。1989年，F(xiàn)UJITA等在大腸桿菌中克隆表達(dá)PseudomonasstutzeriMO-19來源的麥芽四糖淀粉酶[4]。MAALEJ等用PseudomonasstutzeriAS22發(fā)酵產(chǎn)酶可達(dá)6.9 U/mL[6]。FOGARTY等用Pseudomonassp.IMD 353發(fā)酵產(chǎn)酶可達(dá)13 U/mL，是目前報道的最高水平[5]。2014年，韋云萍等在枯草芽孢桿菌1A747中克隆表達(dá)了PseudomonassaccharophilaIAM1504來源的麥芽四糖淀粉酶，并證明其水解淀粉生成的產(chǎn)物以麥芽四糖為主[22]。

2011年，LEE等使用Bacilluslicheniformis來源的麥芽四糖淀粉酶能夠從液化淀粉中產(chǎn)生>45%的麥芽四糖[13]。2013年，杰能科公司錢瑩等對Pseudomonassaccharophila來源的改造后的新型麥芽四糖淀粉酶的反應(yīng)pH、溫度、底物濃度及與普魯蘭酶的協(xié)同作用進(jìn)行探究，最終生成麥芽四糖的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)54%，是目前報道的最高水平[24]。

Pseudomonassaccharophila來源的麥芽四糖淀粉酶水解淀粉生成的產(chǎn)物以麥芽四糖為主。本研究采用前期構(gòu)建的Pseudomonassaccharophila來源的麥芽四糖淀粉酶重組枯草芽孢桿菌，通過對培養(yǎng)基中氮源和碳源優(yōu)化，降低發(fā)酵成本。并利用重組麥芽四糖淀粉酶制備麥芽四糖，對制備條件進(jìn)行加酶量、溫度、pH、底物濃度和反應(yīng)時間的優(yōu)化，提高麥芽四糖轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 菌株與儀器

BacillussubtilisWS11(含有本實(shí)驗(yàn)室改造的高效表達(dá)載體pHY300PLK-g4)。

SHA-1102C空氣恒溫?fù)u床，上海精密儀器儀表有限公司；Agilent 1200高效液相色譜，美國Agilent公司；FE28-Standard pH計，瑞士Mettler-Toledo公司；UV-1700紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司；HZ-9212SB恒溫水浴搖床，太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。

TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24，蛋白胨12，甘油5，K2HPO412.54，KH2PO42.31。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)麥芽四糖淀粉酶

種子培養(yǎng)：從-80 ℃保藏的甘油管中接25 μL的菌液至10 mL的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)8～10 h。

搖瓶發(fā)酵：將種子液以5%的接種量接入TB培養(yǎng)基(無甘氨酸)，37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)至OD600約為1.5(約2 h)，降溫至33 ℃進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，離心15 min收集上清，即為麥芽四糖淀粉酶粗酶液。

1.2.2 重組麥芽四糖淀粉酶酶活的測定

測定體系為15 mL，以1 mL的10 g/L的可溶性淀粉為底物，加入0.9 mL的緩沖液(50 mmol/L 的Na2HPO4-檸檬酸，pH 7.0)，空白對照加入1.0 mL的緩沖液，在55 ℃水浴保溫10 min，加入0.1 mL的酶液，反應(yīng)10 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴7 min，冰水冷卻，定容至15 mL，在OD540下測吸光度值。酶活定義：每分鐘生成1 μmol麥芽四糖所需要的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.2.3 麥芽四糖淀粉酶的搖瓶優(yōu)化

氮源種類及濃度優(yōu)化：按照上述搖瓶發(fā)酵的方法用豆粕粉、玉米漿、工業(yè)蛋白胨、大豆蛋白胨、牛蛋白胨、魚蛋白胨替換TB培養(yǎng)基中的氮源酵母粉和蛋白胨，終質(zhì)量濃度均為35 g/L，探究單一氮源對發(fā)酵的影響，并在此基礎(chǔ)上考察組合氮源及不同濃度配比對重組菌的生長及發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

碳源種類及濃度優(yōu)化：在上述基礎(chǔ)上用甘油、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、玉米糊精和可溶性淀粉替換TB培養(yǎng)基中的碳源甘油，終質(zhì)量濃度均為5 g/L，探究最優(yōu)碳源并在此基礎(chǔ)上考察不同濃度的碳源對重組菌的生長及發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，設(shè)置碳源質(zhì)量濃度為1～25 g/L。

1.2.4 制備麥芽四糖的反應(yīng)條件優(yōu)化

pH值對酶反應(yīng)的影響：以150 g/L麥芽糊精(DE 5～7)為底物，分別用pH 6.0、7.0、8.0、 9.0的50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液溶解底物，加酶量30 U/g底物，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為50 ℃的水浴搖床中，轉(zhuǎn)化12 h，用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測麥芽四糖生成量。

溫度對酶反應(yīng)的影響：以150 g/L麥芽糊精(DE 5～7)為底物，用50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH為7.0)溶解底物，加酶量30 U/g底物，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度分別為40、45、50、55、60 ℃的水浴搖床中，轉(zhuǎn)化12 h，用HPLC檢測麥芽四糖生成量。

加酶量對酶反應(yīng)的影響：以150 g/L麥芽糊精(DE 5～7)為底物，用50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH為7.0)溶解底物，加酶量分別為10、20、30、40、50 U/g，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為50 ℃的水浴搖床中，轉(zhuǎn)化12 h，用HPLC檢測麥芽四糖生成量。

底物濃度對酶反應(yīng)的影響：分別以質(zhì)量濃度為150、 200、 250、 300 g/L麥芽糊精(DE 5～7)為底物，用50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 7.0)溶解底物，加酶量30 U/g底物，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為50 ℃的水浴搖床中，轉(zhuǎn)化12 h，用HPLC檢測麥芽四糖生成量。

反應(yīng)時間對酶反應(yīng)的影響：以250 g/L麥芽糊精(DE 5～7)為底物，用50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 7.0)溶解底物，加酶量30 U/g底物，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為50 ℃的水浴搖床中，轉(zhuǎn)化2、4、8、12、18 h，用HPLC檢測麥芽四糖生成量。

1.2.5 HPLC檢測含量

酶反應(yīng)后的樣品經(jīng)過加熱20 min滅酶后，12 000 r/min 離心10 min，取上清用去離子水適當(dāng)稀釋，再用乙腈共沉淀，放置2 h后，12 000 r/min離心10 min，取上清過膜備用。HPLC檢測條件是：Agilent 1 200 HPLC色譜儀，Agilent自動進(jìn)樣器，色譜柱4.6 mm×250 mm×5 μm Syncronis Amino Column；Aginent示差檢測器；流動相為V(乙腈)：V(水)=70∶ 30，超聲脫氣20 min，流速為0.8 mL/min；柱溫35 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶優(yōu)化

枯草芽孢桿菌的發(fā)酵常用TB培養(yǎng)基，但在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中要求培養(yǎng)基成分廉價且利于菌株生長和產(chǎn)酶。使用TB培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)麥芽四糖淀粉酶的成本較高，對此分別優(yōu)化氮源種類及濃度、碳源種類及濃度。

2.1.1 重組菌TB培養(yǎng)基發(fā)酵

將重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定粗酶液的酶活，麥芽四糖淀粉酶胞外酶的酶活為147 U/mL，破壁上清的酶活為0.6 U/mL，這表明99%的酶都分泌到了胞外，即重組菌成功表達(dá)麥芽四糖淀粉酶。

2.1.2 氮源種類及濃度優(yōu)化

菌體生長及產(chǎn)酶需要消耗氮源來合成自身所需的營養(yǎng)物質(zhì)，不同種類氮源的含氮量不同，選擇合適的氮源對發(fā)酵過程十分重要。酵母類氮源，例如：酵母粉、酵母浸膏等價格普遍昂貴，不適合應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)當(dāng)中，為了降低成本，本研究不選取此類氮源。選取價格較廉價的豆粕粉、玉米漿、工業(yè)蛋白胨、大豆蛋白胨、牛蛋白胨、魚蛋白胨，探究最優(yōu)的單一氮源。

由圖1可以看出只有工業(yè)蛋白胨的產(chǎn)酶效果略好于TB培養(yǎng)基，酶活力可達(dá)174 U/mL。玉米漿和豆粕粉對菌體的生長有利，兩者對應(yīng)的OD600值分別為8.8和8.3。綜合考慮，選取工業(yè)蛋白胨、玉米漿、豆粕粉作為單一氮源，進(jìn)一步探究氮源濃度對發(fā)酵的影響。

圖1 氮源種類對重組菌生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of the different nitrogen sources on cell growth and recombinant G4-amylase activity

分別在培養(yǎng)基中添加15、25、35 g/L的上述氮源替代TB中的氮源，從表1中可以看出工業(yè)蛋白胨濃度為25和35 g/L時，酶活力基本一致，從降低成本的角度出發(fā)可選取25 g/L。

表1 氮源濃度對重組菌生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Table 1 Effects of the concentration of nitrogen sources on cell growth and recombinant G4-amylaseactivity

隨著玉米漿和豆粕粉質(zhì)量濃度的增加，酶活逐漸升高，當(dāng)玉米漿質(zhì)量濃度為35 g/L時，酶活力可達(dá)123 U/mL，當(dāng)豆粕粉質(zhì)量濃度為35 g/L時，酶活力可達(dá)91 U/mL。工業(yè)蛋白胨的價格高于玉米漿，豆粕粉價格最低，可以用工業(yè)蛋白胨分別與玉米漿和豆粕粉復(fù)配，進(jìn)一步探究組合氮源對發(fā)酵的影響。

以上述結(jié)果為基礎(chǔ)，初步考察復(fù)合氮源的不同比例，設(shè)定工業(yè)蛋白胨的質(zhì)量濃度5 g/L為固定值，分別與5、15、25、35和45 g/L的玉米漿和豆粕粉復(fù)配。從圖2中可以看出，當(dāng)玉米漿質(zhì)量濃度為45 g/L時，酶活力為131 U/mL，低于豆粕粉質(zhì)量濃度為15 g/L時的酶活力(143 U/mL)，并且玉米漿價格高于豆粕粉。綜合考慮，選取豆粕粉與工業(yè)蛋白胨組合進(jìn)一步考察不同配比的影響。利用正交表做2因素3水平實(shí)驗(yàn)，從表2中可以看出，當(dāng)工業(yè)蛋白胨質(zhì)量濃度為25 g/L和豆粕粉質(zhì)量濃度為25 g/L時，酶活力可高達(dá)225 U/mL。

a-豆粕粉；b-玉米漿圖2 氮源組合對重組菌生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of complex nitrogen sources on cell growth and recombinant G4-amylase activity

表2 氮源組合對重組菌生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Table 2 Effects of complex nitrogen sources on cell growth and recombinant G4-amylase activity

氮源及質(zhì)量濃度/(g·L-1)OD600酶活力/(U·mL-1)TB5.8±0.2152±3工業(yè)蛋白胨5+豆粕粉56.7±0.2115±3工業(yè)蛋白胨5+豆粕粉158.1±0.2138±3工業(yè)蛋白胨5+豆粕粉258.9±0.2158±3工業(yè)蛋白胨15+豆粕粉56.5±0.2166±3工業(yè)蛋白胨15+豆粕粉158.3±0.2181±3工業(yè)蛋白胨15+豆粕粉259.1±0.2192±3工業(yè)蛋白胨25+豆粕粉57.1±0.2191±3工業(yè)蛋白胨25+豆粕粉158.7±0.2219±3工業(yè)蛋白胨25+豆粕粉259.6±0.2225±3

2.1.3 碳源種類及濃度優(yōu)化

碳源不僅可以提供菌體生長所需的細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)，更重要的是提供合成次級代謝產(chǎn)物所需要的碳及能量。培養(yǎng)基中碳源的濃度過低會導(dǎo)致菌體衰老和自溶，過高會抑制菌體生長及產(chǎn)酶。合適的碳源有利于菌體的快速吸收和利用，選取常見的碳源甘油、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、玉米糊精、可溶性淀粉探究最優(yōu)的單一碳源。

從圖3中可以看出以麥芽糖為單一碳源時，酶活力最高可達(dá)211 U/mL，以玉米糊精或甘油為單一碳源時，酶活均為209 U/mL，考慮到工業(yè)化生產(chǎn)過程中的成本問題，甘油較其他2種碳源更廉價，綜合考慮，選取甘油作為單一碳源，進(jìn)一步探究碳源濃度對發(fā)酵的影響。

圖3 碳源種類對重組菌生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of the different carbon sources on cell growth and recombinant G4-amylase activity

分別在培養(yǎng)基中添加0、1、5、10、15、20、25 g/L甘油替代TB中的碳源，從圖4中可以看出當(dāng)甘油濃度為5 g/L時，酶活力最高可達(dá)236 U/mL，此時OD600值為12.5。

圖4 碳源濃度對重組菌生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of the concentration of carbon sources on cell growth and recombinant G4-amylase activity

此后，隨著碳源濃度的增加，酶活呈下降趨勢，這是因?yàn)楦邼舛鹊奶荚匆鸱纸獯x物阻遏效應(yīng)，使胞內(nèi)的cAMP水平下降，不足以使分解物激活蛋白CAP的構(gòu)象發(fā)生變化成為激活狀態(tài)，無法結(jié)合到啟動子上游，從而導(dǎo)致RNA聚合酶不能與啟動基因結(jié)合，抑制對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，不利于菌體生長和產(chǎn)酶。

2.2 麥芽四糖制備條件優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)初始pH優(yōu)化

如圖5所示，酶催化生成的麥芽四糖隨著pH值的增加變化較明顯，當(dāng)pH 7.0時，麥芽四糖的得率達(dá)到最大68.9%。過高的pH值會使麥芽四糖的得率下降，這是因?yàn)閜H會改變酶活性中心的基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響酶與底物分子的結(jié)合效率，這一趨勢與酶學(xué)性質(zhì)相匹配。所以，麥芽四糖淀粉酶轉(zhuǎn)化麥芽糊精過程中的最適pH值為7.0。

圖5 初始pH對麥芽四糖酶反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of initial pH on the enzymatic conversion

2.2.2 反應(yīng)溫度優(yōu)化

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上對反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，如圖6所示，溫度對麥芽四糖的得率影響較大，當(dāng)溫度為50 ℃時，麥芽四糖的得率達(dá)到最大69.6%。此后繼續(xù)提高溫度，麥芽四糖的得率開始下降。從前期對麥芽四糖淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的研究可知，當(dāng)溫度高于55 ℃ 時，該酶的熱穩(wěn)定性逐漸變差。由于高溫使酶的穩(wěn)定性變差，因而半衰期縮短，催化效率降低，從而麥芽四糖的得率下降。所以，麥芽四糖淀粉酶轉(zhuǎn)化麥芽糊精過程中的最適溫度為50 ℃。

圖6 溫度對麥芽四糖酶反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of temperature on the enzymatic conversion

2.2.3 加酶量優(yōu)化

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上對反應(yīng)所需加酶量進(jìn)行優(yōu)化，如圖7所示，麥芽四糖的產(chǎn)量隨著加酶量的增加而升高，當(dāng)加酶量為30 U/g時，麥芽四糖的得率達(dá)到最大69.7%。此后繼續(xù)提高加酶量，麥芽四糖的得率略有下降。這是因?yàn)?，加酶量的增加使底物有更多的機(jī)會與酶分子結(jié)合從而提高得率，當(dāng)加酶量達(dá)到一定值后，酶與底物的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)，再提高加酶量也不會有多余的底物與酶分子結(jié)合，反而會使酶團(tuán)聚在一起從而降低得率。所以，麥芽四糖淀粉酶轉(zhuǎn)化麥芽糊精過程中的最適加酶量為30 U/g。

圖7 加酶量對麥芽四糖酶反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of enzyme dosage on the enzymatic conversion

2.2.4 底物濃度優(yōu)化

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上對反應(yīng)的底物濃度進(jìn)行優(yōu)化，高底物濃度有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，如圖8所示，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為250 g/L時，麥芽四糖的得率達(dá)到最大73%。濃度過高時，麥芽四糖的得率下降明顯。這可能是因?yàn)榈孜餄舛仍黾拥阶畲蠛螅械拿阜肿佣寂c底物結(jié)合，處于飽和狀態(tài)，再提高底物濃度反而會使糊精分子相互聚集，減少底物與酶分子的接觸從而降低得率。同時，底物濃度過高也會使底物抑制作用明顯。所以，麥芽四糖淀粉酶轉(zhuǎn)化麥芽糊精過程中的最適底物質(zhì)量濃度為250 g/L。

圖8 底物濃度對麥芽四糖酶反應(yīng)的影響Fig.8 Effect of substrates concentration on the enzymatic conversion

2.2.5 反應(yīng)時間優(yōu)化

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上對反應(yīng)的時間進(jìn)行優(yōu)化，如圖9所示，在酶反應(yīng)12 h時麥芽四糖的得率達(dá)到最大值73%，12 h后得率開始下降。酶反應(yīng)過程中，起始的2 h內(nèi)酶催化反應(yīng)速率是整個反應(yīng)過程中的最大值。在2 h到12 h內(nèi)，催化反應(yīng)速率逐漸減小。因此，麥芽四糖淀粉酶轉(zhuǎn)化麥芽糊精合成麥芽四糖的最適反應(yīng)時間為12 h。

圖9 反應(yīng)時間對麥芽四糖酶反應(yīng)的影響Fig.9 Effect of transform time on the enzymatic conversion

3 討論

在前期獲得了能夠分泌表達(dá)麥芽四糖淀粉酶的重組枯草芽孢桿菌菌株的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)初步試驗(yàn)表明重組菌發(fā)酵上清液中麥芽四糖淀粉酶的酶活力可達(dá)147 U/mL。之后進(jìn)一步探討了重組菌在搖瓶中產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)基，當(dāng)使用豆粕粉和工業(yè)蛋白胨為氮源，甘油為碳源時，麥芽四糖淀粉酶的酶活力最高可達(dá)236 U/mL。利用廉價的培養(yǎng)基獲得了相對較高的酶活，比Pseudomonassp.IMD 353來源的該酶的最高產(chǎn)酶水平13 U/mL[5]高18倍，比培養(yǎng)基優(yōu)化前的酶活高約1倍。采用該麥芽四糖淀粉酶探究了酶法生產(chǎn)麥芽四糖的工藝條件，結(jié)果表明，反應(yīng)pH值為7.0，溫度為50 ℃，加酶量為30 U/g底物，底物麥芽糊精質(zhì)量濃度為250 g/L，轉(zhuǎn)化時間12 h，麥芽四糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)73.2%，比目前已有報道的最高水平54%[19]高19%，為工業(yè)化生產(chǎn)麥芽四糖提供了研究基礎(chǔ)。

本研究使用經(jīng)過載體和宿主菌改造而得到的高表達(dá)重組菌，完成了其在搖瓶中的優(yōu)化及在制備麥芽四糖中的應(yīng)用。重組菌高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件有待優(yōu)化，提高酶活的同時降低發(fā)酵成本，以實(shí)現(xiàn)麥芽四糖淀粉酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。