楊忠敏，王祖文，沈以紅，丁曉雯，黃先智*

1(西南大學 食品科學學院，重慶市農產品加工重點實驗室，重慶，400716) 2(西南大學 蠶學與系統(tǒng)生物學研究所，重慶，400716)

在機體內，抗氧化防御系統(tǒng)與活性氧始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這個平衡被破壞，具有高反應活性的氧自由基基團就能直接造成機體生物膜系統(tǒng)的損傷，從而導致正常細胞裂解死亡[1]。過剩的氧自由基會誘導機體發(fā)生氧化應激，氧化機體蛋白質、脂質、DNA等生物大分子[2]，導致多種疾病的發(fā)展或發(fā)生。因此，尋找活性高、副作用低且能改善機體生物大分子氧化損傷的天然抗氧化物質對維持機體健康具有重要意義。

桑葉是我國衛(wèi)生部公認的“藥食同源”植物資源，現(xiàn)已被廣泛應用于食品生產領域[3-4]。而桑葉生物堿是其重要活性成分之一，具有降糖、降脂、抗病毒、抗腫瘤等功效[5-6]。目前國內外有關桑葉生物堿對生物大分子氧化應激作用影響的研究主要在改善脂質氧化方面[7]，對DNA、蛋白質的氧化影響無相關報道。

生物活性成分的抗氧化活性在經過胃腸消化后可能會發(fā)生變化[8]。而生物活性物質在機體內的消化吸收、代謝過程都非常復雜，采用體外消化模擬方法能迅速、準確地評價生物活性物質的功能在機體中的變化，有研究技術簡單、成本低等優(yōu)點[9]。但目前尚無桑葉生物堿在模擬胃、腸消化體系中抗氧化應激能力的研究報道。本研究采用體外模擬胃、腸消化模型，評價桑葉生物堿在不同的消化階段抗氧化應激能力的變化，以期為桑葉生物堿在生物體內抗氧化活性變化與機理研究提供參考，為桑葉在醫(yī)藥及保健食品的應用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉粉末，品種為勝利大葉，重慶市蠶業(yè)科學技術研究院提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)，購自美國Sigma公司；Gene Green核酸染料，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；FeCl3、FeSO4、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine, DNPH)、鹽酸胍、乙酸乙酯，均購自Mackin Biochemical公司；豬胰酶、熒光素鈉、β-胡蘿卜素、亞油酸，購自Aladdin Industrial Corporation；胃蛋白酶、膽汁鹽、2,4,6-三吡啶基三嗪(tripyridyltriazine, TPTZ)、水溶性VE(Trolox)、2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2’-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride, AAPH)、牛血清蛋白、哌嗪-N,N’-雙(2-乙磺酸)(piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES)、PUC-19質粒DNA、瓊脂糖、10×Loading buffer、50×TAE電泳緩沖液，均購自Solarbio life sciences；三氯乙酸、醋酸鈉、無水乙醇、HCl、冰乙酸、H2O2、NaH2PO4、Na2HPO4、三氯甲烷、吐溫-80、乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraaceticacid, EDTA)，抗壞血酸，均購自成都科龍試劑。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Symergy H1酶標儀，基因有限公司；RE52CS-1旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-88恒溫搖床，常州朗越儀器制造有限公司；811DK高速冷凍離心機，Eppendorf AG；DYY-6D DNA凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GenoSens 1860凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學儀器有限公司；XW-80A 微型旋渦混合儀，上海瀘西儀器廠儀器有限公司；KQ5200DB超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 主要方法

1.3.1 桑葉生物堿制備

稱取桑葉粉，按料液比1∶30(g∶mL)，60 ℃，功率800 W，超聲處理60 min，重復提取2次，合并濾液，減壓濃縮；將濃縮液以2.1 BV/h流速過D101大孔樹脂；再將過D101的純化液以2.5 BV/h流速過732型陽離子樹脂吸附，先用蒸餾水洗至中性，再用0.5 mol/L氨水洗滌，然后以2倍柱體積洗脫的氨水洗脫液清洗；再將氨水洗脫液以2.1 BV/h流速過AB-8大孔樹脂，干燥得樣品[10-11]。本實驗所制得的桑葉生物堿中總生物堿含量為93.57%。

1.3.2 體外模擬胃、腸消化

1.3.2.1 體外模擬胃消化

據(jù)MILLER等[12]體外模擬消化法對桑葉生物堿進行模擬消化。取8.0 g桑葉生物堿，加入80 g生理鹽水，沸水浴15 min。冷卻后，采用去離子水將樣品的懸濁液恒質量至88 g制得勻漿，用1 mol/L HCl溶液將pH調至2.0。

胃空白對照組(S0組)：取20 g調節(jié)pH后的均漿液，加入0.25 mL的去離子水。

鹽酸對照組(S1組)：取20 g調節(jié)pH后的均漿液，加入0.25 mL 0.01 mol/L HCl溶液。

胃消化組(S2組)：取20 g調節(jié)pH后的均漿液，加入0.25 mL的模擬胃液(0.2 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L HCl溶液)。

3個實驗組均避光并充入氮氣，于37 ℃恒溫水浴搖床中消化3 h。分別在反應0、0.5、1、2、3 h時取出一定質量的液體，4 ℃離心(12 000 r/min，15 min)，取上清液于-20 ℃凍存，備用。

1.3.2.2 體外模擬腸消化

按照模擬胃液方法制備胃消化2 h的勻漿樣品，然后用1 mol/L NaHCO3溶液調節(jié)pH至7.0。

腸空白對照組(G0組)：取20 g調節(jié)pH后的勻漿樣品，加入0.5 mL 0.1 mol/L NaHCO3緩沖溶液；

腸消化組(G1組)：取20 g調節(jié)pH后的勻漿樣品，加入0.5 mL模擬腸液(4 g胰酶、25 g膽汁鹽溶于1 L 0.1 mol/L NaHCO3溶液)。

2個實驗組避光并充入氮氣，于37 ℃恒溫水浴搖床里消化5 h。分別在胃消化0 h、腸消化0、0.5、1、2、3、4、5 h時取出一定質量的懸濁液，4 ℃離心(12 000 r/min， 15 min)，取上清液于-20 ℃凍存，備用。

1.3.3 抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力測定

1.3.3.2 鐵還原能力分析(FRAP值測定)

參照LU等[14]方法進行鐵還原能力分析。結果用每g樣品中μmol FeSO4當量表示，簡寫為“μmol/g”。

1.3.3.3 β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析

根據(jù)SHONM等[15]方法略加修改。在96孔酶標板加入50 μL待測液、200 μL的β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液，搖床80 r/min混勻1 min，50 ℃孵育反應。于470 nm波長處測定初始反應的吸光度以及反應120 min后的吸光度，分別記為Α0和Α120，ΔA=Α0-Α120，ΔA越大表明β大胡蘿卜素氧化程度越高、褪色越多，計算見公式(1)。

(1)

式中：ΔA0表示不加樣品抑制時的褪色情況；ΔAi表示樣品加入后產生抑制作用時的褪色情況。

1.3.3.4 ORAC值測定

參照HUANG等[16]方法進行測定，結果表示為μmol Trolox當量每10 g樣品(μmol Trolox/10 g md)。

1.3.3.5 蛋白羰基測定

蛋白羰基含量的測定參照保健評價技術評價與規(guī)范修改稿測定[18]。

1.3.3.6 DNA保護潛力測定

根據(jù)ZHANG等[19]進行DNA保護潛力的測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品重復測定3次，結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示；實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 19.0軟件、Image Lab軟件分析；圖表采用Origin 9.0軟件。

2 結果與分析

2.1 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化中抗氧化活性

2.1.1 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化中DPPH自由基的清除能力

桑葉生物堿模擬胃腸消化對DPPH清除能力結果如圖1所示。

a-胃消化；b-腸消化圖1 桑葉生物堿模擬胃腸消化的DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging effect capacity of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion注：*表示顯著性差異(P<0.05)，**表示極顯著差異(P<0.01)。下同。

由圖1-a可知，在胃消化中，S0、S1組對DPPH清除能力呈現(xiàn)緩慢增長，而S2在0～1 h增長緩慢增；1～2 h內，清除能力增長較為顯著，從268.90 mmol Trolox /100 g md增長到 504.67 mmol Trolox /100 g md，增長率為88%，2～3 h增長又恢復平穩(wěn)。在胃消化階段，S0、S1組之間不存在顯著性差異，當胃消化達2 h時，S2組與2個對照組存在極顯著差異(P<0.01)； S2組在3 h時對DPPH清除能力達最大值，較0 h時提高了2.9倍(P<0.01)。

由圖1-b可知，在腸消化中，G0組對DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，而G1組在0～1 h平穩(wěn)增長，1～2 h顯著增長，從562.30 mmol Trolox /100 g md增長到 686.47 mmol Trolox /100 g md，增長率為22%，2～5 h增長恢復平穩(wěn)。在整個腸消化階段，G1組與G0組存在極顯著差異(P<0.01)；G1組在5 h時對DPPH自由基清除能力達最大值，是 0 h的1.46倍(P<0.01)。

2.1.2 桑葉生物堿模擬體外胃腸消化中鐵還原能力分析

桑葉生物堿模擬胃腸消化FRAP結果如圖2所示。

a-胃消化；b-腸消化圖2 桑葉生物堿在模擬胃腸消化中的鐵還原能力分析Fig.2 FRAP analysis of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion

由圖2-a可知，在胃消化過程中，S0、S1組FRAP值均呈現(xiàn)平穩(wěn)增長，S2組0～2 h FRAP值呈現(xiàn)快速增長，從687.33 μmol/g增長到869.56 μmol/g，增長率為27%，2～3 h增長相對平穩(wěn)。在胃消化階段，S0、S1組之間不存在顯著性差異，消化達1 h，S2組與2對照組存在顯著差異(P<0.05)，消化達2 h時，存在極顯著差異(P<0.01)；S2組在3 h時FRAP值達最大，是0 h的1.98倍(P<0.01)。

由圖2-b可知，在腸消化中，G0組FRAP值平穩(wěn)增長。G1組的FRAP值在0～1 h平穩(wěn)增長，1～2 h顯著增長，從1 410.667 μmol/g增長到1 601.778 μmol/g，增長率為14%；2～5 h恢復增長平穩(wěn)。在腸消化達 2 h 時，G1組與G0組存在極顯著差異(P<0.01)； G1組在5 h時的FRAP值達到最大，是0 h的1.32倍(P<0.01)。

2.1.3 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化中β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析

桑葉生物堿在模擬胃腸消化中β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析結果如圖3所示。

a-胃消化；b-腸消化圖3 桑葉生物堿胃腸消化β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析Fig.3 Antioxidant effect of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion on β-carotene-linoleic acid system

由圖3-a可知，在胃消化中，S0、S1組對β-胡蘿卜素的褪色抑制率呈現(xiàn)緩慢增長，其抑制率很低，表明桑葉生物堿在這2種環(huán)境下的抗氧化作用不強，而S2組0～0.5 h的抑制率緩慢增加；0.5～2 h，抑制率增加很快并達到峰值；2～3 h抑制率的平穩(wěn)增加；S2組在3 h時抑制率達最大，是0 h的3.78倍(P<0.01)；隨著胃消化時間的延長，S2組逐漸降低H2O2對β-胡蘿卜素的漂白作用，其抑制率為16.99%～64.23%。

由圖3-b可知，在腸消化階段，G0組對β-胡蘿卜素褪色抑制率呈現(xiàn)緩慢增長；而G1組0～1 h內抑制率相對平穩(wěn)增長，1～4 h其抑制率從69.80%增長到93.93%，增長迅速，4～5 h其抑制率又平穩(wěn)增長，G1組在5 h時對β-胡蘿卜素褪色的抑制率達到最大值，為95.14%，是0 h的1.49倍(P<0.01)。在腸消化時間階段，桑葉生物堿對β-胡蘿卜素褪色的抑制率為63.85%～95.14%，逐漸減緩H2O2對β-胡蘿卜素的漂白作用。

2.1.4 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化對ORAC值的影響

671 Application of systematic simulation training program in flexible ureteroscopy training

桑葉生物堿在模擬胃腸消化中對ORAC值的影響結果如圖4所示。

a-胃消化，b-腸消化圖4 桑葉生物堿模擬胃腸液樣品溶液熒光隨時間衰減曲線Fig.4 The attenuation curve of fluorescence intensity of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion

由圖4-a、圖4-b可知，各實驗組均能延緩熒光物質被活性氧自由基淬滅的速度，且順序為S2組>S0組>S1組，G1組>G0組；同一實驗組中隨著消化時間的延長，熒光衰退越慢。對每個樣品平行測定3次，通過Trolox標準曲線計算ORAC值，結果如圖5所示。

a-胃消化；b-腸消化圖5 桑葉生物堿模擬胃腸消化ORAC值變化Fig.5 Changes ORAC of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion注：折線上不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。下同。

由圖5-a可知，在胃消化階段，各實驗組的ORAC值均隨著消化時間延長而呈現(xiàn)增加趨勢；S0、S1組之間存在顯著性差異(P<0.05)，S2組與兩對照組均存在顯著差異(P<0.05)，S2組的ORAC值在3 h時達最大，為0 h的1.61倍(P<0.05)，是S0、S1組消化3 h時的3.41、11.34倍(P<0.05)，表明桑葉生物堿在胃消化液中保持較好抗氧化活性，且隨著消化時間的延長其抗氧化活性是增加的。

由圖5-b可知，在腸消化階段，G1組的ORAC值均顯著高于G0組(P<0.05)；G1組的ORAC值在5 h時達到最大，為腸消化0 h的1.45倍(P<0.05)，是G0組5 h的2.04倍(P<0.05)，同時也是胃消化0 h的1.67倍(P<0.05)，表明經胃腸消化后的桑葉生物堿的抗氧化活性顯著提高。

2.2 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化對蛋白羰基的影響

桑葉生物堿在模擬胃腸消化對蛋白質羰基的影響結果如圖6所示。

由圖6-a可知，未氧化BSA羰基含量1.950 nmol/mg蛋白，氧化12 h后BSA羰基含量驟升到3.324 nmol/mg蛋白。在胃消化中，與氧化BSA對照組相比，S0、S1組與其不存在顯著差異；當胃消化達1 h 時，S2組與氧化BSA、S0、S1組均存在顯著性差異(P<0.05)；隨著消化時間的延長，S2組對BSA羰基含量的上升有顯著抑制作用，抑制率為15.84%～65.84%。

a-胃消化；b-腸消化圖6 桑葉生物堿在模擬胃消化中對BSA羰基的影響Fig.6 Effect of mulberry leaf alkaloid during simulated stomach digestion on carbonyl content of BSA注：圖中線條表示S2、G1組蛋白羰基含量的減少趨勢線。

2.3 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化中DNA保護潛力的測定

體外模擬胃腸消化桑葉生物堿進行DNA保護潛力(抗氧化能力)的測定結果見圖7。

圖7 體外模擬胃腸消化桑葉生物堿對DNA損傷保護Fig.7 The protection of DNA damage of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion注：a-空白組(不經處理的DNA); b-對照組(紫外10 min +體積分數(shù)30% H2O2處理);3～7-S2組(紫外10 min +各時間點的胃消化樣+30% H2O2處理)； 8～12-S1組(紫外10 min+各時間點的鹽酸對照樣+30% H2O2處理)； 13～17-S0組(紫外10 min+各時間點的胃空白對照樣+30% H2O2處理); c～i-G1組(紫外10 min +各時間點的腸消化樣+30%H2O2處理); j～p-G0組(紫外10 min +各時間點的腸空白對照樣+30% H2O2)。

由圖7可知，PUC19質粒DNA在無抗氧化劑的保護作用下，經過紫外線、體積分數(shù)30%H2O2處理后，質粒DNA結構幾乎完全降解成未知的DNA碎片或其他不同分子質量的分子(圖7，泳道2、b)；分別加入模擬的胃腸消化液后，DNA分子受到了不同程度的保護，其作用是G1組>S2組，S0、S1、G0組之間不存在明顯差異，但明顯低于G1、S2組。

為了進一步分析桑葉生物堿對DNA的保護潛力，根據(jù)軟件Image Lab分析得出各泳道中分子質量條帶所占百分比，結果見圖8。

a-胃消化；b-腸消化圖8 各實驗組DNA條帶所占百分比Fig.8 The percentage of DNA bands of each experimental group注：圖中線條表示S2、G1組DNA條帶占百分比的增長趨勢線。

由圖8可知，空白組質粒DNA百分比與對照組存在極顯著差異(P<0.01)，表明體積分數(shù)30%H2O2聯(lián)合紫外線處對PUC質粒DNA具有較大的損傷作用；在胃消化中，S0、S1組與對照組對質粒DNA保護作用在整個胃消化時間范圍內任意兩兩比較均不存在顯著性差異(P>0.05)；在0～0.5 h，S2組質粒DNA百分比與3個對照組間不存在顯著性差異，消化達1 h時，與3個對照組存在顯著性差異(P<0.05)；隨著胃消化時間的延長，S2組對質粒DNA的保護作用增加：其保護率為6.68%～75.67%。在腸消化的過程中，與對照組、G0組相比，G1組對質粒DNA保護作用與其均存在顯著性差異(P<0.05)；隨著腸消化時間的延長，G1組有效保護質粒DNA的損傷：其保護率為70.50%～98.29%。在整個模擬胃腸消化的過程中，G1組對質粒DNA損傷的保護作用強于S2組，表明桑葉生物堿在腸消化清除自由基的作用強于在胃消化的過程。

3 討論與結論

體外模擬胃腸消化系統(tǒng)是一種基于人體胃腸道生理機能進行模擬食物消化行為的生物系統(tǒng)，具有簡單快速的特點[20]。而目前有關生物堿類化合物抗氧化活性研究只有在化學環(huán)境分析而獲得的數(shù)據(jù)，均未考慮其在胃腸道中消化過程可能發(fā)生的變化。本研究采用桑葉生物堿通過體外模擬胃腸消化法，分析桑葉生物堿的抗氧化活性的變化規(guī)律，更加貼近人體對其的消化吸收情況，可為桑葉生物堿在體內的功能性質研究提供參考。

DPPH自由基結構中1個N原子上含有1個未成對的電子，若其含有抗氧化活性物質就會與其配對，深紫色的DPPH自由基就會被還原成黃色的非自由基形式[21]。FRAP分析不是反應對某種自由基的清除能力，而是抗氧化物質的總還原能力。本研究結果表明，桑葉生物堿在模擬胃腸消化的過程中對DPPH自由基的清除能力、FRAP值的變化趨勢相同，在胃、腸消化1 h后，DPPH自由基的清除能力、FRAP值顯著增加，腸消化2 h后均呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，其中在腸消化的抗氧化能力強于胃消化。劉平懷等[22]的研究結果表明，樣品中生物堿與DPPH清除率之間存在劑量效應關系，在1.6 mg/mL時，清除率可達91.59%。單虹宇等[23]研究顯示瑪咖生物堿具有較好還原三價鐵離子能力。與其他生物堿化合物相同，桑葉生物堿經過胃腸消化后對DPPH自由基清除能力、還原三價鐵離子能力均有較強作用。β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的亞油酸被氧化會產生漂白β-胡蘿卜素的H2O2自由基，則向體系中加入抗氧化物質就會對自由基產生作用進而減輕β-胡蘿卜素漂白情況[24]。本研究結果表明胃腸消化0.5、1 h后，桑葉生物堿抑制β-胡蘿卜素褪色率均顯著增加，分別到消化3、5 h后，達到2個消化階段的最大值，分別為該階段的3.78、1.58 倍，且隨消化時間的增加，抑制率加強，表明桑葉生物堿經過胃腸消化后在油脂體系中仍具有較強清除自由基的作用。

ORAC方法具有穩(wěn)定的自由基引發(fā)劑，所產生的自由基與食品、生命現(xiàn)象中的自由基具有高度一致性，且其反應機制是經典的氫轉移反應，是目前體外評價抗氧化物質的主要方法之一[24]。已有研究表明，一些植物(翹果決明、米蘭花等)中的生物堿可以通過與O2發(fā)生碰撞使自身獲得能量，進而使1O2失去活性使其轉變?yōu)?O2，是活性氧(ROS)的淬滅劑[25]。本研究結果表明，在模擬胃腸消化的過程中，隨著消化時間的延長，ORAC逐漸增加，胃腸消化階段的ORAC分別在366.952～591.528、423.877～613.230 μmol Trolox /10 gmd，且腸消化階段的ORAC值大于胃消化階段。推測其主要原因是其在胃、腸消化階段其結構或者電性因素不同，當雜環(huán)中的N原子裸露在外時有利于與ROS相接觸并與之反應，供電基團或者可以使N原子富有電子結構的因素也會增加其抗氧化作用[26]。

綜上，桑葉生物堿經過胃腸消化后具有較強的體外抗氧化作用，且能有效保護DNA、蛋白損傷，其機制有可能是桑葉生物堿的自身立體結構或電性，具體的分子機理還需進一步深入研究。本研究的結果表明，桑葉生物堿可能具有較強的抗氧化作用，有望應用于保健食品領域。