劉麗莉，代曉凝，陳珂，孟圓圓，郝威銘

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023) 2(食品加工與安全國家級教學示范中心(河南科技大學)，河南 洛陽，471023)

我國是畜產(chǎn)品生產(chǎn)大國，牛骨資源豐富，然而只有少數(shù)的蛋白酶可以降解牛骨膠原蛋白，導致長期以來，我國絕大多數(shù)牛骨資源尚未得到有效地開發(fā)利用[1-2]。研究生物酶工程技術開發(fā)出功能性骨蛋白肽，可解決牛骨進行深加工和牛骨資源浪費問題，并具有一定的經(jīng)濟效益，也為我國畜禽骨骼資源的深度開發(fā)提供新思路。牛骨骼中的膠原蛋白經(jīng)酶解后，可以得到骨膠原多肽，它不僅能夠抗氧化、抗衰老、促進礦物質(zhì)吸收等；且在營養(yǎng)吸收方面，比氨基酸或膠原蛋白效果更佳[3-5]。但由于牛骨膠原蛋白溶解性差，以及其特殊的三股螺旋結構，使得牛骨膠原不易被普通的蛋白酶降解。此外，目前能降解骨膠原蛋白的蛋白酶具有底物專一性強，水解程度低的特點，與進入工業(yè)化大生產(chǎn)還有一定距離。

目前微生物源牛骨膠原蛋白酶來源有溶組織梭菌[6],Bacillussp. DPUA 1728[7]，Clostridiumperfringens[8]，Vibriovulnificus[9]，和VibriovulnificusCYK279H[10]等，但是這些菌株大部分為致病菌，會與膠原蛋白酶同時產(chǎn)生相應的毒素，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。因此，目前市售的膠原蛋白酶菌株很少[11-12]。所以，找出安全有效的膠原蛋白酶資源，并提高酶的降解效率成為牛骨膠原蛋白資源深度利用的關鍵問題。研究人員嘗試通過構建工程菌株、基因定向改造、染色體重組等方式來提高原始菌株的產(chǎn)酶效率[13-19]。本研究以課題組篩選的高效降解骨膠原蛋白的菌株B.cereusMBL13-U為出發(fā)菌，測定其全基因組序列，然后采用軟件對產(chǎn)酶功能基因的二級結構和三維結構進行預測，并將目的基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主菌株BL21，構建工程菌。通過此項研究以期為我國畜禽骨骼資源開發(fā)利用提供了新的研究思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus,B.cereus) MBL13-U、宿主菌為大腸桿菌(EscherichiacoliBL21(DE3))、表達載體pET-30a均為課題組保藏菌株。

1.1.2 PCR引物

根據(jù)目的基因和表達載體設計出聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增目的基因的引物。

上游引物序列：CGCGGATCCGCTCTCCCCT ACCTTACATT T(劃線處為BamH I的酶切位點)。

下游引物序列：CCGCTCGAGTAAAAAGGTCGCCGTGAGTGG(劃線處為XhoI的酶切位點)。

1.1.3 工具酶與主要試劑

ExTaqDNA聚合酶、內(nèi)切酶(BamHⅠ和XhoⅠ)、T4 DNA連接酶、DNA Marker(DL5 000、DL12 000)、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，Marker TaKaRa公司；卡那霉素(Kana)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，北京索萊寶公司；DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，北京GENVIEW公司；基因組提取試劑盒，德國Analytik Jena公司；牛血清白蛋白，眾一生物公司；Agarose(AR)，德國Analytik Jena公司；50 X TAE(AR)，吉格生物科技(廣州)有限公司；牛跟腱Ⅰ型膠原蛋白，源葉生物有限公司。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

B.cereusMBL13-U種子培養(yǎng)基：100 mL去離子水中分別加入牛肉膏1.0 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，自然pH。在121 ℃下滅菌20 min，冷卻待用。

LB培養(yǎng)基：在100 mL的去離子水中分別加入NaCl 1.0 g，酵母粉0.5 g，胰蛋白胨1.0 g，在121 ℃下滅菌20 min，冷卻待用。

LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)：向100 mL的去離子水中加入NaCl 1.0 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨1.0 g，于121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻后向其中加入50 mg/mL 卡那霉素100 μL。

固體培養(yǎng)基：加1.5%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂于上述培養(yǎng)基中，即成相應固體培養(yǎng)基。

1.1.5 儀器與設備

GeneAmp9700 PCR儀，美國Applied Biosystems公司；DY04-13立式壓力滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；JY92-IIN超聲波細胞破碎儀，寧波新芝科技有限公司；LGJ-25C冷凍離心機，湘儀儀器(湖南)開發(fā)有限公司；JY600E SDS電泳儀、WD-9413A凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司；H1650離心機，湘儀儀器(湖南)開發(fā)有限公司；UV-1800紫外光譜掃描儀，日本島津公司；TM3030Plus掃描電鏡，日本Jeol有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 全基因組測序

提取收集菌株的基因組送至上海源序生物科技有限公司測序。所得Solexa數(shù)據(jù)采用velvet V1.2.03軟件進行拼接。

1.2.2 基因組數(shù)據(jù)分析

搜尋NCBI的NR庫、KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫以及SEED蛋白數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋，將拼接生成的基因組序列進行開放閱讀框(ORF)預測、基因功能注釋分析、KEGG代謝途徑分析。

1.2.3 膠原蛋白酶的結構預測

在上述研究獲得的膠原蛋白酶功能基因序列的前提下，先采用DNA翻譯工具ExPASy將基因序列翻譯為相對應的氨基酸序列，用SOPMA在線預測該蛋白酶的二級結構，利用NCBI的BLAST工具以及Phyre2在線分析平臺等工具對膠原蛋白酶的三維結構進行預測[9]。

1.2.4 ColM13基因克隆

以提取的B.cereusMBL13-U基因組DNA為模板，使用設計出的一對特異性引物進行目的片段的擴增。PCR反應的體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL， 上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ExTaqDNA DNA聚合酶 0.15 μL，ddH2O 17.5 μL，總體積25 μL。PCR擴增過程為在94 ℃條件下反應4 min進行預變性；在95 ℃條件下反應1 min進行變性；在51 ℃條件下反應1 min進行退火；在72 ℃條件下反應1.5 min進行延伸；在72 ℃條件下反應10 min終止延伸，35個循環(huán)。反應結束在4 ℃條件下保存一段時間并抽取PCR產(chǎn)物，用1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 大腸桿菌BL21感受態(tài)的制備

感受態(tài)細胞的制備在代軍[20]、張跡[21]的基礎上略加改善。本試驗中采用預冷的已滅菌80 mmol/L MgCl2-20 mmol/L CaCl2溶液對菌體細胞進行重懸，冰上冷卻25 min后離心；再采用已滅菌且預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液(含30%(體積分數(shù))甘油)，輕輕振蕩使細胞重懸，然后將菌液以200 μL/管進行分裝(冰上操作)，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組表達載體pET30a-ColM13及工程菌的構建

在37 ℃條件下用BamHI、XhoI對純化的PCR產(chǎn)物和表達載體pET-30a進行雙酶切，用T4 DNA連接酶對雙酶切的產(chǎn)物(酶切產(chǎn)物已進行膠回收純化)進行連接，完成重組表達載體pET30a-ColM13的構建。在16 ℃下酶連3 h左右，將重組表達載體pET30a-ColM13轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21混勻，完成工程菌pET30a-ColM13/BL21的構建。其中，轉(zhuǎn)化條件[22]為：冰上預冷30 min后在42 ℃條件下水浴熱激90 s；再次冰上預冷2～5 min后轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中并加入已滅過菌的LB培養(yǎng)基，以37 ℃、180 r/min恒溫培育60 min。無菌條件下，抽取200 μL菌液涂于LB固體平板(含Kana)上，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取單克隆菌落，接入5 mL LB培養(yǎng)液(含Kana)，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。然后將培養(yǎng)物離心，收集菌體并按質(zhì)粒提取試劑盒的說明書(GENVIEW公司)從工程菌中提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定及序列測定。

1.2.7 重組蛋白酶ColM13的誘導表達

為檢驗構建出的工程菌是否能夠表達所需要的重組蛋白酶ColM13。誘導表達時采用IPTG誘導法，主要是在處于對數(shù)生長期的工程菌培養(yǎng)液中加入0.1%(體積分數(shù))為100 mmol/mL的IPTG，在37 ℃的恒溫振蕩器以180 r/min的條件培養(yǎng)4 h，然后離心收集菌體進行超聲破碎，再次離心，上清即為重組蛋白酶。最后進行SDS-PAGE電泳檢測[23-24]。

1.2.8 重組蛋白酶ColM13 酶解骨膠原蛋白的結構分析

1.2.8.1 紫外(UV)掃描分析

將骨膠原蛋白分別用BSC和ColM13進行處理，在近紫外區(qū)對處理過的樣品進行200～400 nm的全波長掃描。

1.2.8.2 掃描電鏡(SEM)分析

分別將膠原蛋白原樣與用ColM13處理的膠原蛋白經(jīng)真空冷凍干燥后進行噴金處理后用掃描電鏡觀察表面結構的變化。

2 結果與分析

2.1 全基因測序分析

2.1.1 Solexa數(shù)據(jù)拼裝

采用軟件velvet V1.2.03對Solexa數(shù)據(jù)進行拼裝，拼裝后共得到78個重疊群(Contig)，Contig的平均長度為73 449 bp，總長為5.7 Mb，其中最長的Contig為683 kb。拼裝結果詳見表1。

表1 拼裝統(tǒng)計結果Table 1 The results of assemble

2.1.2 基因預測

通過glimmer 3.02 對出發(fā)菌株的基因組進行基因預測，結果如表2。

表2 基因預測的結果Table 2 The results of gene prediction

可知其含5 989個基因；通過tRNA-scan發(fā)現(xiàn)84個tRNA序列；使用RNA mmer分析軟件從菌株的基因組中預測出6個rRNA序列。圖1顯示基因長度的分布情況。

圖1 基因長度分布Fig.1 The fraction of gene length

由圖1可知，基因長度在0.5 kb以下的為36.0%，基因長度在0.5～1 kb以下的為35.6%，基因長度在1～1.5 kb以下的為18.8%。綜上可知，90%以上的基因長度都在1.5 kb以下。

2.2 基因功能注釋及代謝途徑分析

搜尋NCBI的NR庫、KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫以及SEED蛋白數(shù)據(jù)庫對所測膠原蛋白酶進行基因功能注釋，利用CDD數(shù)據(jù)庫進行COG分類。通過KEGG數(shù)據(jù)庫構建代謝通路。分析可知共有5 831個蛋白具有生物學功能。3 715個蛋白具有COG分類，結果見圖2；1 610個蛋白具有KEGG的同源基因(ortholog)，結果見圖3；所有蛋白匹配的同源蛋白來源于341個物種，分類情況如圖4所示。

圖2 COG功能統(tǒng)計Fig. 2 The function statistics of COG

圖3 KEGG代謝通路的類型Fig. 3 The type of KEGG metabolic pathway

圖4 同源蛋白的類型Fig. 4 The type of homologous protein

由圖2可知，COG功能主要包括：氨基酸、碳水化合物的轉(zhuǎn)運與代謝；細胞與染色體的分裂等。由圖3可知，KEGG代謝通路的類型主要分為四大類：(1)代謝；(2)遺傳信息處理；(3)環(huán)境信息處理；(4)細胞過程。

其中，代謝主要為各種物質(zhì)及能量的代謝；遺傳信息處理主要指的是：轉(zhuǎn)錄，翻譯，折疊、排序和退化，復制和修復；環(huán)境信息處理包括：膜運輸、信號轉(zhuǎn)導、信號分子和交互；細胞過程指的是細胞運輸和分解代謝、細胞活性、細胞生長和死亡、細胞群體。由圖4可知，所有蛋白匹配的同源蛋白中Bacilluscereus比例最高，達到47.9%。

2.3 功能基因的定位

經(jīng)過上述基因組數(shù)據(jù)分析，從全基因組序列中得到膠原蛋白酶的功能基因序列長度為2 916 bp。序列號為CP023179.1。

2.4 膠原蛋白酶的結構預測

根據(jù)獲得的目的基因序列，通過SOPMA在線預測該蛋白的二級結構，結果表明該功能基因中α螺旋占總氨基酸的37.1%，β轉(zhuǎn)角占總氨基酸的12.8%，無規(guī)則卷曲占總氨基酸的26.0%。利用NCBI的BLAST工具以及Phyre2在線分析平臺等工具對膠原蛋白酶的三維結構進行預測，結果如圖5所示。

A-模塊結構;B-三級結構圖5 膠原蛋白酶的模塊結構和膠原蛋白酶的三級結構預測Fig.5 Module structure of collagenase and prediction of the tertiary structure of collagenase

由圖5-A可知，NCBI的BLASTp分析結果表明膠原酶含有的4個保守的結構域：氨基酸殘基序列中97～279位是M9肽酶家族N端結構域(peptidase family M9N-terminal)，該結構域最初從微生物來源的膠原酶-金屬蛋白酶中發(fā)現(xiàn)；氨基酸殘基序列中從359～621位是谷氨酸-鋅肽酶家族結構域(collagenase)，這個酶家族主要用于分解膠原蛋白；氨基酸殘基序列中的774～843位是多囊性腎病蛋白結構域(PKD)，PKD結構域可能是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-碳水化合物相互作用中的配體，在結合位點處起作用；氨基酸殘基序列891～956位是細菌前肽酶C末端結構域(bacterial pre-peptidaseC-terminal domain)，該結構域通常在分泌的細菌肽酶的C端發(fā)現(xiàn)，它們可能與PKD(pfam00801)結構域所發(fā)揮的作用相類似。

將所得的膠原蛋白酶基因序列在Phyre2在線分析平臺模擬其三維結構，由圖5-B可知，該蛋白酶的三維結構呈現(xiàn)出鑷子狀結構。

2.5 ColM13基因克隆

由圖6可知，在2號泳道均出現(xiàn)目的條帶，大小約2 916 bp與預期的ColM13基因片段大小相符。采用DNA回收試劑盒快速純化回收PCR擴增的產(chǎn)物，抽取樣品送至北京六合華大公司進行測序，結果表明PCR結果正確。

M-DL 5 000 Marker；1-擴增的目的片段圖6 PCR擴增產(chǎn)物檢測Fig.6 PCR amplification product detection

2.6 重組子的檢測

由圖7-A可知，泳道2和3種酶切重組子后并未出現(xiàn)兩條條帶；泳道4出現(xiàn)2條條帶，說明挑取的3個工程菌的菌落中泳道4的菌落可能重組成功。因此就泳道4提取的工程菌的質(zhì)粒增加對照類型，電泳驗證結果如圖7-B所示。結合圖7-B可知，泳道7雙酶切后的工程菌的質(zhì)粒出現(xiàn)兩條條帶，其中上方條帶為酶切后的質(zhì)粒條帶，下方條帶為酶切后目的基因條帶，并且這兩條條帶與pET-30a(+)空載體和PCR擴增出ColM13的基因片段大小基本一致。由此得出，工程菌pET-30a-ColM13/BL21(DE3)已成功構建。

A-M：DL 5 000 Marker；1：單酶切后pET-30a(+)質(zhì)粒載體；2-4：雙酶切后重組質(zhì)粒；B-M：DL 12000 Marker；泳道1：原目的片段；泳道2：pET-30a(+)空質(zhì)粒；泳道3：雙酶切后目的片段；泳道4：雙酶pET-30a(+)質(zhì)粒；泳道5：重組質(zhì)粒；泳道6：單酶切后pET-30a(+)質(zhì)粒；泳道7：雙酶切后重組質(zhì)粒圖7 重組子酶切驗證Fig. 7 The enzyme digestion verification of the recombinant

2.7 ColM13的誘導表達

經(jīng)過對ColM13誘導表達的優(yōu)化，將工程菌pET30a-ColM13/BL21和空質(zhì)粒菌pET30a/BL21在37 ℃的條件下加入為6‰的IPTG進行誘導，誘導時間為6 h。ColM13表達情況如圖8所示。

M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker；1-pET-30a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入后經(jīng)IPTG誘導；2-重組子轉(zhuǎn)入后未經(jīng)IPTG誘導；3-重組子轉(zhuǎn)入后經(jīng)IPTG誘導圖8 SDS-PAGE檢測Fig. 8 SDS-PAGE detect

由圖8可知，與未經(jīng)IPTG誘導的工程菌相比，加入IPTG誘導后構建的工程菌中的目的蛋白質(zhì)得到表達。誘導表達的蛋白與Marker進行對比，其分子質(zhì)量約為46 kDa。

2.8 UV光譜分析

膠原蛋白肽鏈中的-C=O、-COOH、-CONH2為生色基團，蛋白質(zhì)溶液形成紫外吸收光譜即是蛋白分子中各種紫外生色基團加和的結果[25]。本實驗的紫外圖譜檢測結果如圖9所示。

圖9 膠原蛋白酶解前后的紫外光譜分析Fig.9 Analysis of UV spectrum before and after enzymatic hydrolysis of collagen

2.9 ColM13作用于膠原蛋白的掃描電鏡分析

將表達的ColM13作用于膠原蛋白，對酶解前后的膠原蛋白進行掃描電鏡分析，結果如圖10所示。

A-膠原蛋白原樣；B-ColM13處理的膠原蛋白圖10 膠原蛋白酶解前后的掃描電鏡圖Fig.10 The SEM of collagen before and after enzymatic hydrolysis

由圖10可知，將誘導表達出的ColM13酶作用于膠原蛋白后，膠原蛋白的結構發(fā)生明顯變化。其中，膠原蛋白呈現(xiàn)為顆粒狀結構，表面凹凸不平，但顆粒的整體性較好；但經(jīng)ColM13處理后膠原蛋白的結構由顆粒狀轉(zhuǎn)變成層狀或者片段分列，表面均勻、細膩光滑，這是由于ColM13將膠原蛋白降解為小分子多肽，破壞了其分子表面結構[28]，從而表明ColM13在工程菌中已成功表達。

3 結論

(1)本研究將課題組篩選的B.cereusMBL13-U作為目標菌株，根據(jù)其全基因組測序分析獲得產(chǎn)酶的功能基因序列，采用velvet V1.2.03對數(shù)據(jù)進行拼裝，搜尋NCBI的NR庫、KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫以及SEED蛋白數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋，確定膠原蛋白酶的基因序列長度為2 916 bp。

(2)采用SOPMA在線預測可知該蛋白的二級結構，結果表明該功能基因中α螺旋占總氨基酸的37.1%， β轉(zhuǎn)角占總氨基酸的12.8%，無規(guī)則卷曲占總氨基酸的26.0%。利用NCBI的BLAST工具以及Phyre2在線分析平臺等工具對膠原蛋白酶的三維結構進行預測，表明該膠原蛋白酶呈現(xiàn)為鑷子狀三維結構。

(3)以B.cereusMBL13-U基因組DNA為模板進行PCR擴增，將目的片段克隆至質(zhì)粒pET-30a，成功構建出表達型工程菌大腸桿菌(E.coliBL21(DE3))，通過全波長紫外掃描光譜和掃描電鏡對工程菌所產(chǎn)的工程蛋白酶ColM13酶解Ⅰ型骨膠原蛋白后的結構進行分析。表明工程菌構建成功，這對骨膠原蛋白酶結構特性的相關研究及其在生產(chǎn)領域的應用具有重要意義。