陳姝璇，康楊婷，石海燕，伍國鋒，王麗琨

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴陽550004)

癲癇是多種原因?qū)е碌哪X部神經(jīng)元高度同步化異常放電的臨床綜合征，以反復的自發(fā)性發(fā)作為主要特征。約有30%的癲癇患者經(jīng)過系統(tǒng)正規(guī)的藥物治療，仍不能得到有效控制，成為耐藥性癲癇,耐藥性癲癇反復發(fā)作會給患者心理、認知等方面帶來嚴重的負面影響，同時也增加患者的病死率[1,2]。有研究顯示，癲癇的發(fā)生可能是由于神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性遞質(zhì)和興奮性遞質(zhì)的不平衡引起的。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元激發(fā)的調(diào)控主要是通過抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)進行，GABA與GABA受體結(jié)合后可發(fā)揮抑制作用。GABA受體分為離子型GABAA受體和代謝型GABAB受體。GABAA受體可介導抑制性突觸后電流從而對癲癇發(fā)作產(chǎn)生抑制作用[3,4]。GABAB受體可調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和遲發(fā)性抑制性突觸后電位，在控制癲癇的興奮性方面起重要作用[5]。目前，GABA受體與癲癇耐藥是否有關(guān)仍未明確。2014年9月～2017年7月，我們建立了耐藥性顳葉癲癇大鼠模型， 觀察了GABA受體表達變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級健康成年雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量200～250 g,日齡50～60 d，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗前將動物置于實驗室1周適應環(huán)境，單籠喂養(yǎng)，自由進食和飲水，室溫21～25 ℃，自然采光，無自發(fā)性癲癇發(fā)作的大鼠入選。BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)、DW-2000腦立體定向儀、HF30型可拆式屏蔽室(中國成都泰盟科技有限公司)，苯妥英鈉(中國武漢遠城科技發(fā)展有限公司)，苯巴比妥鈉(中國上海新亞藥業(yè)有限公司)，小型垂直電泳槽、全濕電轉(zhuǎn)印裝置、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國加州Bio-Rad公司)，Anti-GABAA antibody、Anti-GABAB antibody(美國Abcam公司)，HRP-RAbbit Anti-Chicken IgY(IgG)、PV6001-3ml 兔kit、TRIS、酶標條12孔、SDS、甲醇(中國北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.2 耐藥性顳葉癲癇模型的建立及鑒定 氯化鋰125 mg/kg腹腔注射，18～24 h后給予硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min后首劑腹腔注射匹羅卡品30 mg/kg，30 min后若無Racines分級[6]Ⅳ級以上發(fā)作，可每隔30 min注射10 mg/kg追加劑量，直至出現(xiàn)Ⅳ級以上無明顯間歇的癲癇持續(xù)狀態(tài)。注射匹羅卡品后，若大鼠反復出現(xiàn)IV～V級發(fā)作視為大發(fā)作，即氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型建立成功。氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型建立成功2周后，給予苯巴比妥25 mg/kg，1次/d,連續(xù)給予2周，然后記錄大鼠癲癇發(fā)作頻率及持續(xù)時間。若用藥后癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間減少≥50%為對苯巴比妥敏感，即藥物敏感癲癇大鼠；若氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型大鼠癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間減少<50%為對苯巴比妥耐藥的癲癇大鼠，此時需選擇第2種抗癲癇藥苯妥英鈉75 mg/kg，1次/d,連續(xù)給予2周；若癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間減少<50%為對苯妥英鈉耐藥，對苯巴比妥和苯妥英鈉均耐藥的大鼠為耐藥型大鼠[7]。本研究中SD大鼠60只，成功建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型25只，使用苯巴比妥和苯巴比妥耐藥性篩選后篩選出藥物敏感16只，耐藥癲癇大鼠9只。用隨機數(shù)字法從敏感大鼠中選取8只作為藥物敏感組，從耐藥大鼠中選取8只作為耐藥組，再選擇8只正常SD大鼠作為對照組。觀察、記錄并分析各組大鼠癲癇發(fā)作程度、發(fā)作級別，并將各組癲癇大鼠的大腦右側(cè)海馬植入電極，連接于腦電圖記錄儀，觀察并記錄腦電圖的頻率、波幅變化。藥物敏感組癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作級別、發(fā)作持續(xù)時間分別為(1.43±1.10)次、(2.63±0.52)級、(35.38±2.92)s，耐藥組分別為(3.96±1.12)次、(4.88±0.35)級、(66.75±5.73)s。與藥物敏感組比較，耐藥組癲癇發(fā)作次數(shù)增加，發(fā)別級別升高，發(fā)作持續(xù)時間延長(P均<0.05)。腦電圖提示典型的癲癇波型有單棘波、多相棘波、雙相棘波、棘慢波、陣發(fā)性高幅尖波節(jié)律，其中以多發(fā)棘波為主且頻繁出現(xiàn)。耐藥組發(fā)作前以快波和單棘波為主，發(fā)作前、發(fā)作時癲癇波頻率、波幅及發(fā)作后波幅高于藥物敏感組(P均<0.05)，見表1。以上結(jié)果提示耐藥性顳葉癲癇模型建立成功。

表1 癲癇發(fā)作前、中、后兩組腦電圖癲癇波頻率、 波幅比較

注：與藥物敏感組同時間相比，＊P<0.05。

1.3 三組海馬組織GABAA受體和GABAB受體的檢測 ①采用免疫組織化學染色法檢測海馬組織GABAA受體、GABAB受體。10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射大鼠，待大鼠麻醉后應用冷生理鹽水及4%多聚甲醛灌注，取含有海馬結(jié)構(gòu)的2～3 mm厚冠狀切面腦組織，固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、脫蠟、水化，于3%過氧化氫室溫孵育10 min，PBS沖洗3次×5 min，后選用乙二胺四乙酸二鈉修復抗原，待冷卻后給予PBS沖洗3次×5 min，滴入正常山羊血清工作液，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次×5 min，每張片加入50 U二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min，每張片加DAS染色液100 μL，蘇木素復染，脫水、透明、封片。以細胞膜或細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)者判定陽性細胞。PBS代替一抗為陰性對照。利用MIAS圖像分析系統(tǒng)在400倍視野下每張切片選擇5處陽性細胞測定其平均光密度值(MOD)。②采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測海馬組織GABAA受體、GABAB受體。將大鼠麻醉后斷頭取腦，取出海馬組織放入研磨器，加入裂解液和PMSF(終濃度為1 mmol/L),充分勻漿后，4 ℃、120 000 r/min離心15 min取上清，蛋白定量后，加入5×上樣緩沖液混勻，將其置入沸水中，煮沸5 min，使蛋白變性。用移液器將按比例配好的8%的分離膠10 mL緩慢加入制膠板中，避免氣泡產(chǎn)生，再將5%的濃縮膠灌于玻璃板中，立即將干凈的梳子插入濃縮膠。每例蛋白樣品按4∶1的比例在樣品中加入4×加樣緩沖液，加入蛋白質(zhì)Marker，初電壓80 V電流強度進行電泳，至分離線后調(diào)電壓至120 V，當目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上結(jié)束。將濾紙、PVDF膜切成與凝膠尺寸大小一致，用兩張大濾紙貼于兩張多孔墊料，將PVDF膜夾于中間成三明治結(jié)構(gòu)，4 ℃、250 mA恒流轉(zhuǎn)移2 h。PVDF膜用PBS沖洗15 min×2次，封閉液中搖蕩1 h后用TBST洗3遍，加入一抗4 ℃過夜后用TBST洗3遍。過夜后孵育二抗1 h,洗膜5 min×3次,將發(fā)光液A和發(fā)光液B按1∶1比例混勻倒在PVDF膜上，發(fā)光液蓋住膜即可，曝光。蛋白質(zhì)免疫印跡法所檢測的蛋白條帶采用Image J測量軟件分析，計算累計光密度(IOD)值,采用目的條帶的IOD值/對應的內(nèi)參(β-actin，GAPDH)IOD值得出IOD比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

免疫組化染色法檢測海馬組織GABAA受體、GABAB受體結(jié)果顯示，對照組大鼠海馬組織的細胞膜和細胞質(zhì)可見大量棕黃色或棕褐色GABAA受體顆粒，顏色深；藥物敏感組仍可見大量棕褐色GABAA受體顆粒，但較對照組少；耐藥組僅可見少量棕褐色GABAA受體顆粒(圖1)。對照組大鼠海馬組織的細胞核和細胞質(zhì)可見大量棕黃色或棕褐色GABAB受體顆粒，顏色深；敏感組仍可見大量棕褐色GABAB受體顆粒，但較對照組少；耐藥組僅可見少量棕褐色GABAB受體顆粒(圖2)。三組GABAA、GABAB受體MOD值、IOD值比較見表1。

表1 三組海馬組織GABAA、GABAB受體表達比較

注：與對照組比較，#P<0.05，與藥物敏感組比較，*P<0.05。

圖1 三組GABAA受體的表達(免疫組化法)

圖2 三組GABAB受體的表達(免疫組化法)

圖3 三組GABAA受體和GABAB受體的表達

3 討論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其臨床表現(xiàn)為抽搐發(fā)作，具有反復發(fā)作和不可預測性，然而，目前癲癇及耐藥性癲癇的病因大多未可知[7，8]。應用動物癲癇模型及大量的動物實驗來揭開耐藥性癲癇的病因及本質(zhì)為目前研究癲癇的主要方法。本研究中應用氯化鋰-匹羅卡品成功建立癲癇大鼠模型，該模型操作較方便，可直觀觀察記錄用藥前后癲癇發(fā)作時間、發(fā)作頻率、發(fā)作次數(shù)等指標以觀察癲癇大鼠對抗癲癇藥物的反應性，適合于臨床藥物篩選的研究，也可用于研究癲癇發(fā)作的機制[9]，是較理想動物癲癇模型。本研究中，在癲癇發(fā)作時，耐藥組及藥物敏感組癲癇大鼠均有腦電圖改變，可見棘波、尖波、尖慢波等癲癇樣波，提示顳葉癲癇模型建立成功。

只有在普通癲癇模型的基礎上經(jīng)過作用機制不同的2種抗癲癇藥物治療足夠時間，仍然無效才能認為是耐藥性癲癇模型。Bethmann等[10]用苯巴比妥及苯妥英鈉對杏仁核點燃癲癇大鼠模型進行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對苯巴比妥耐藥的癲癇大鼠中，80%左右對苯妥英鈉也耐藥。這兩種抗癲癇藥物是作用機制完全不同的一線抗癲癇藥，苯巴比妥作用于γ-GABA受體，激活氯離子通道導致突觸后模超極化，從而抑制突觸后神經(jīng)元的活動；而苯妥英鈉為鈉通道阻滯劑，阻斷鈉離子內(nèi)流從而抑制癲癇病灶內(nèi)神經(jīng)元的激活。本研究中我們也選用此兩種藥物作為耐藥性癲癇的篩選，成功建立了耐藥性顳葉癲癇模型。本研究結(jié)果顯示，與藥物敏感組比較，耐藥組癲癇發(fā)作次數(shù)增加、發(fā)別級別升高、發(fā)作時間延長。耐藥組發(fā)作前癲癇波(發(fā)作前主要以快波和單棘波為主)頻率，發(fā)作時頻率、波幅及發(fā)作后波幅高于藥物敏感組，提示耐藥癲癇模型成功建立。

在癲癇發(fā)病機制中，一致的觀點是癲癇腦組織內(nèi)存在興奮功能與抑制功能的病理性失衡，即以谷氨酸為代表的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能增強或以GABA為代表的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能減弱[11]。在癲癇患者與癲癇動物的腦組織中存在GABA抑制性中間神經(jīng)元的丟失[12]以及GABAA受體介導的抑制性神經(jīng)元的紊亂[13]，癲癇發(fā)作與GABA的釋放、免疫活動和結(jié)合位點的變化相關(guān)。GABAA受體受癲癇持續(xù)狀態(tài)的影響而發(fā)生改變。研究[14]發(fā)現(xiàn)，急性期癲癇發(fā)作能抑制GABAA受體的功能，GABAA受體的拮抗劑有助于誘導癲癇的發(fā)作，而能提高GABAA神經(jīng)傳遞功能的藥物則具有抗驚厥作用。GABAB受體也參與了癲癇活動 ，在癲癇動物的海馬中，GABAB受體減少[15]，缺乏GABAB受體的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出全身性癲癇發(fā)作活動，GABAB受體拮抗劑可誘發(fā)或加重癲癇發(fā)作活動[16]。在癲癇患者的海馬中GABAB受體在突觸前降低，改變突觸前后神經(jīng)細胞抑制性突觸后電位[17]，從而誘發(fā)癲癇發(fā)作。

癲癇耐藥的重要原因之一為治療靶點對抗癲癇藥物失去反應性。GABA受體門控氯離子通道在癲癇耐藥的發(fā)生發(fā)展中作用突出，腦細胞外液GABA含量減少可以觸發(fā)癲癇發(fā)作并維持癲癇狀態(tài)存在[18]，增強GABA系統(tǒng)的功能是難治性癲癇治療的重要策略。GABAA受體在腦內(nèi)主要由2個α1、2個β2和1個γ2亞基組成。改變GABAA受體亞型,比如α1、α5、γ2可能與抗癲癇藥物的耐藥密切相關(guān)[19]，且GABAA受體可能是耐藥性癲癇治療的靶點[20]。GABAA受體γ2亞基被認為是苯二氮唑類藥物的作用靶點[21]，其被證明與癲癇發(fā)作、神經(jīng)退化及抗癲癇藥物的耐藥密切相關(guān)[22]。 本研究表明，與藥物敏感組比較，耐藥組癲癇大鼠癲癇發(fā)作級別升高，持續(xù)時間延長及發(fā)作次數(shù)增加，海馬組織GABAA和GABAB受體表達降低，可能是耐藥性癲癇大鼠腦組織中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABAA、GABAB受體降低，導致GABAA和GABAB受體介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性作用減弱，促進癇性反復發(fā)作。

綜上所述，在耐藥性癲癇大鼠海馬組織中GABAA受體和GABAB受體表達降低，癲癇發(fā)作明顯加重，提示GABA受體可能參與了癲癇發(fā)生耐藥的機制。本文不足之處在于僅發(fā)現(xiàn)了在耐藥性癲癇中GABAA和GABAB受體降低，但并沒有探討其降低的原因及引起耐藥性癲癇的機制，有待進一步探討。