武鳳霞,張淑彬,應(yīng)夢真,劉建斌

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不同培養(yǎng)基濃度對土壤耐低溫微生物分離效果的影響

武鳳霞,張淑彬,應(yīng)夢真,劉建斌*

北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所, 北京 100097

從環(huán)境中分離篩選具有特定功能的純培養(yǎng)微生物是微生物應(yīng)用研究的基礎(chǔ)，而提高環(huán)境微生物的可培養(yǎng)性是篩選純培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。本研究以常規(guī)微生物分離培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度為基礎(chǔ)，對貧營養(yǎng)、富營養(yǎng)培養(yǎng)基在低溫條件下（8℃）獲得的培養(yǎng)物進行比較分析，了解培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度對低溫土壤微生物分離培養(yǎng)的影響，以期為特殊培養(yǎng)基的設(shè)計及多培養(yǎng)基組合提高土壤低溫微生物的可培養(yǎng)性提供思路和依據(jù)。結(jié)果表明在低溫培養(yǎng)條件下，稀釋培養(yǎng)基營養(yǎng)成分可以提高耐低溫可培養(yǎng)性微生物種類，但會降低耐低溫可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。通過比較低溫條件下實驗室分離培養(yǎng)方法和16 sRNA高通量測序法對常年低溫環(huán)境土壤微生物多樣性分析，通用常規(guī)方法無法分離和培養(yǎng)出土壤中的絕大部分微生物，且通過常規(guī)方法分離培養(yǎng)出來的微生物也不一定是土壤環(huán)境的優(yōu)勢菌群。

稀釋營養(yǎng); 微生物多樣性; 培養(yǎng)基; 可培養(yǎng)性

地球生態(tài)環(huán)境低溫區(qū)占80%以上，這些環(huán)境里生存著種類繁多且分布廣泛的微生物，但被我們發(fā)現(xiàn)的微生物只占整個低溫微生物中的冰山一角，還有很多低溫微生物因為我們技術(shù)及設(shè)備的原因尚未被發(fā)現(xiàn)[1]。微生物的分離、純化、培養(yǎng)計數(shù)等純培養(yǎng)技術(shù)一直是微生物學(xué)研究的基石，也是微生物應(yīng)用研究的基礎(chǔ)，但是，研究表明自然界中絕大多數(shù)微生物尚不能被目前的純培養(yǎng)技術(shù)所培養(yǎng)[2,3]。低的環(huán)境微生物可培養(yǎng)性使獲得純培養(yǎng)菌株特別是有特殊功能的新的菌株變得更不容易,因而對這類微生物形態(tài)、生理特性、代謝功能等生命活動規(guī)律的研究受限，純培養(yǎng)技術(shù)的局限已經(jīng)成為微生物應(yīng)用研究特別是低溫微生物應(yīng)用研究的主要瓶頸[4,5]。在改進微生物培養(yǎng)方法、開發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)方面國內(nèi)外開展了較多的研究工作，分離獲得了一批新的微生物菌株。如通過改變培養(yǎng)基的配方、降低培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、添加某些微生物生長因子可顯著提高平板培養(yǎng)的土壤微生物種類和數(shù)量；采用多種培養(yǎng)基組合亦可提高土壤微生物的可培養(yǎng)性。這些基于可培養(yǎng)層面上的發(fā)現(xiàn)及近年來發(fā)展起來諸如宏基因組學(xué)等分子生物學(xué)技術(shù)和手段極大地推動對自然界中微生物功能資源的開發(fā)和應(yīng)用[6]。本研究以常規(guī)微生物分離培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度為研究基點，對貧營養(yǎng)、富營養(yǎng)培養(yǎng)基在8℃條件下獲得的培養(yǎng)物進行分析比較，以了解營養(yǎng)濃度對低溫土壤微生物分離培養(yǎng)的影響，從而為特殊培養(yǎng)基的設(shè)計及多培養(yǎng)基組合提高土壤低溫微生物的可培養(yǎng)性提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 土壤樣品采集于新疆賽里木湖湖畔，年平均氣溫8~10 ℃，無菌袋取樣后冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基本實驗所用培養(yǎng)基是LB、TSB、R2A、PDA、YPD、高氏培養(yǎng)基（G）及該6種培養(yǎng)基1/4稀釋液、1/10稀釋液培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)濃度把LB、TSB、PDA、YPD、G定為富營養(yǎng)培養(yǎng)基，LB、TSB、PDA、YPD、G培養(yǎng)基1/4稀釋液和R2A定為中度營養(yǎng)培養(yǎng)基、LB、TSB、PDA、YPD、G培養(yǎng)基1/10稀釋液、1/4R2A定為貧營養(yǎng)培養(yǎng)基，R2A1/10稀釋液為極貧營養(yǎng)培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均購置于Coolaber公司。

1.2 低溫微生物馴化培養(yǎng)及稀釋涂布分離

涉及培養(yǎng)基5%接種土壤后在8 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化4次。取1 mL培養(yǎng)液進行梯度稀釋涂布后置于8 ℃培養(yǎng)4 d，每天定時統(tǒng)計各平板菌落數(shù)、菌種類別，菌種類別用平板菌落形態(tài)觀察和顯微鏡革蘭氏染色相結(jié)合的方法。

1.3 低溫可培養(yǎng)微生物的分離鑒定

分離獲得的耐低溫菌純化后用細(xì)菌基因組提取試劑盒（Tiangen Biotech CO.,LTD）提取DNA后進行16 SrDNA基因擴增（引物為27 f和1492 R），PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。測序數(shù)據(jù)在NCBI進行Blast比對后初步確定分離菌株種類。

1.4 土壤樣品微生物組成高通量測定

-80 ℃保藏土壤樣品由美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行土壤細(xì)菌16 SrRNA Illumina Miseq平臺測序。測序公司負(fù)責(zé)將測序結(jié)果進行OTU劃分并進行基礎(chǔ)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 8 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)基分離土壤微生物種類

土樣經(jīng)連續(xù)4次馴化后在相應(yīng)培養(yǎng)基平板8 ℃培養(yǎng)96 h分離獲得微生物全部為細(xì)菌，各培養(yǎng)基分離獲得細(xì)菌種類見圖1。從圖1看出經(jīng)1/4稀釋的R2A培養(yǎng)基獲得的細(xì)菌種類最多，YPD、LB、TSB培養(yǎng)基1/10稀釋處理篩選獲得的細(xì)菌種類均高于原培養(yǎng)基。本實驗結(jié)果表明在低溫（8 ℃）條件下，培養(yǎng)基貧營養(yǎng)更有利于分離獲得更多的微生物種類。

圖 1 8 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)基分離土壤微生物種類

圖 2 8 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)基分離土壤微生物菌落總數(shù)

2.2 8 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)基分離土壤微生物菌落總數(shù)

8 ℃培養(yǎng)條件下6種培養(yǎng)基不同濃度在不同時段內(nèi)分離獲得的土壤耐低溫菌株平板計數(shù)結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，耐低溫菌株在6種培養(yǎng)基生長菌落數(shù)量差別較大，YPD、高氏一號、TSB、R2A培養(yǎng)基原濃度平板獲得有效活菌數(shù)量最高，而且稀釋濃度越高處理獲得的有效活菌數(shù)數(shù)量越小，說明高濃度營養(yǎng)成分有助于提高平板的有效活菌數(shù)獲得。LB培養(yǎng)基1/4稀釋的培養(yǎng)基處理分離獲得的可培養(yǎng)微生物數(shù)量最多，PDA培養(yǎng)基則為1/10倍稀釋的培養(yǎng)基處理獲得的微生物數(shù)量最多。分析可見低溫條件下（8 ℃）培養(yǎng)基富營養(yǎng)有助于微生物菌落數(shù)量獲得。

2.3 低溫可培養(yǎng)微生物的分離鑒定結(jié)果

新疆土經(jīng)連續(xù)4次馴化后在相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋分離獲得微生物全部為細(xì)菌。根據(jù)平板菌落形態(tài)和革蘭氏染色顯微鏡觀察分離獲得10株不同的細(xì)菌，經(jīng)分離、純化和基因測序?qū)Ρ冉Y(jié)果如表1所示。8 ℃條件馴化分離獲得細(xì)菌主要集中在變形菌門，-變形菌綱下的假單胞屬、沙雷菌屬和節(jié)桿菌屬。

表 1 低溫可培養(yǎng)細(xì)菌16 SrRNA比對結(jié)果

2.4 土壤樣品細(xì)菌組成高通量測定結(jié)果

圖 3 不同分類水平上（門、綱、目、科、屬）的細(xì)菌分類

土壤樣品進行細(xì)菌高通量測序后，獲得46069條有效序列，依據(jù)Barcode標(biāo)簽進行序列拆分共獲得422個OUT（97%相似度），在綱、目、科、屬水平上進行分類（見圖3），綱水平上百分含量最多的是(放線菌綱)的細(xì)菌，約占總量的33.59%，其它占比在5%以上的依次是（甲型變形菌綱）、（酸桿菌門）、（芽單胞菌門）；目上平上能夠比對的占比最多的是（根瘤菌目），約占總量的8.53%，其次占比在5%以上的依次有（酸桿菌目）、（放線菌目）、（黃單胞菌目）；科水平上能夠占比大于4%的依次是（酸桿菌）、（放線菌）（芽單胞菌科）、（微球菌科）、（黃單胞菌科）；屬水平上占比最多的細(xì)菌分別是（酸桿菌）、（放線菌）、（芽單胞菌科）、（微球菌科）。

3 討論

常規(guī)的微生物分離篩選培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富但相對單一，而自然環(huán)境多數(shù)屬于“貧營養(yǎng)”但營養(yǎng)元素豐富。因此，利用富營養(yǎng)但營養(yǎng)元素少的普通培養(yǎng)基從自然環(huán)境中篩選分離適應(yīng)了寡營養(yǎng)狀態(tài)的微生物，往往在一定程度上會變現(xiàn)出不可培養(yǎng)性[7]。本研究基本印證了這一結(jié)果，在低溫（8 ℃）條件下1/4倍稀釋的R2A培養(yǎng)基篩選分離到的細(xì)菌種類最多，高氏一號、LB、TSB、YPD培養(yǎng)基均表現(xiàn)出1/10倍稀釋的培養(yǎng)基處理較原濃度培養(yǎng)基可以分離更多微生物種類的特點。可見稀釋培養(yǎng)基營養(yǎng)成分即中度或貧營養(yǎng)培養(yǎng)基更有利于提高環(huán)境微生物的可培養(yǎng)性。

4 結(jié)論

一些研究者提出有些條件下，培養(yǎng)基中過高的營養(yǎng)物質(zhì)會抑制一些微生物的生長，因此利用富營養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基進行環(huán)境微生物分離，篩選獲得的微生物數(shù)量并非最多[8]。本研究結(jié)果顯示在8 ℃培養(yǎng)條件下YPD、高氏一號、TSB、R2A培養(yǎng)基原濃度平板獲得有效活菌數(shù)量最高，而且稀釋濃度越高處理獲得的有效活菌數(shù)數(shù)量越小，只有LB培養(yǎng)基1/4稀釋的培養(yǎng)基處理分離獲得的可培養(yǎng)微生物數(shù)量最多，PDA培養(yǎng)基則為1/10倍稀釋的培養(yǎng)基處理獲得的微生物數(shù)量最多。說明培養(yǎng)基營養(yǎng)成分濃度對環(huán)境耐低溫微生物可培養(yǎng)性和數(shù)量獲得同樣具有重要的影響。通過連續(xù)馴化和培養(yǎng)基稀釋分離獲得土壤優(yōu)勢菌群分布在變形菌門、-變形菌綱、假單胞目、假單胞科的假單胞屬、變形菌門、-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科的沙雷菌屬和變形菌門、放線菌綱、放線菌目、微球菌科的節(jié)桿屬，沒有篩選分離到真菌。

利用分子生物學(xué)方法對采集土樣進行細(xì)菌高通量測序，獲得的46069條有效序列經(jīng)Barcode標(biāo)簽法拆分為422個OTU，在綱的水平上含量最多的(放線菌綱)，約占總量的33.59%，其次是（甲型變形菌綱）；在目的水平上占比最多的是（根瘤菌目），其次是（酸桿菌目）；在科水平上占比最大的是（酸桿菌）、其次是（放線菌），在屬水平上占比最多是（酸桿菌）、其次是（放線菌）；比較低溫條件下實驗室分離培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)方法對常年低溫環(huán)境土壤微生物多樣性分析結(jié)果可以看出，培養(yǎng)方法分離獲得的土樣優(yōu)勢菌群分布在變形菌門、-變形菌綱中，而分子生物學(xué)法分析的細(xì)菌類群在變形菌門、變形菌綱中均有分布，但多樣性更高。比較兩種方法分析結(jié)果在分類學(xué)目水平以下幾乎沒有共同類群，說明通過常規(guī)微生物分離方法無法分離獲得土壤中的絕大部分耐低溫微生物，且分離篩選獲得的耐低溫微生物也不一定是土壤環(huán)境的優(yōu)勢菌群。

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Effects of Nutrient Medium Concentrations on Isolation of Cold Adapted Microorganisms

WU Feng-xia, ZHANG Shu-bin, YING Meng-zhen, LIU Jian-bin*

100097,

Improving the culturability of soil microorganism and isolating pure strains are the base of the study of applied microbiology. The cold-adapted microorganisms was isolated from the soil of SayramLake by using traditional nutrient medium and dilution of traditional nutrient medium and six traditional nutrient medium were used for this study. Results showed that the approach of dilute the traditional nutrient medium could increase the culturability of cold-adapted microorganism in the conditionof 8 ℃. But the amount of the cold-adapted microorganism cultured on dilution of traditional nutrient medium was lower than those on traditional nutrient medium. The results of the 16S rRNA sequencing showed that only a small proportion of cold-adapted microorganisms in the sample was recovered by culturing techniques.

Dilute nutrient broth; microbial diversity; culturemedium; culturability

S18

A

1000-2324(2019)02-0315-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.02.030

2018-03-12

2018-04-25

北京市農(nóng)林科學(xué)院青年基金(QNJJ201707);北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)項目(KJCX20190407);國家重點研發(fā)計劃(2017YFD0201607)

武鳳霞(1980-),女,碩士,助理研究員,主要從事土壤微生物應(yīng)用研究. E-mail:wufengxia0570@163.com

Author for correspondence. E-mail:liujianbin1981@126.com