雷子穎 唐鴻生(通訊作者) 阮強(qiáng) 王佳泓 王進(jìn) 黃永紅

510095廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腹部綜合外科

胃癌是消化道中最常見的惡性腫瘤之一，其重要的生物學(xué)特征之一就是侵襲和轉(zhuǎn)移，亦是胃癌患者死亡的主要原因。雖然隨著臨床診斷與治療水平的提高，胃癌的治療與診斷水平有了明顯的提高，但是其惡性度高、易轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致胃癌患者死亡率高的重要原因。目前對于胃癌的治療仍以手術(shù)為主，但尚有一部分患者因體質(zhì)或胃癌分期較晚而無法選擇手術(shù)，化療是替代手術(shù)治療的一種方法[1]。但部分患者存在對化療藥物無效及耐藥的情況。miR-101 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種對于腫瘤化療耐藥過程起作用的微小RNA，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮類似抑癌基因作用，為探究其對胃癌化療耐藥的影響，特進(jìn)行本次研究。

資料與方法

材料：本次研究所用到的主要試劑與材料是人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1、人胃癌SGC7901 細(xì)胞系、胃癌耐藥SGC7901細(xì)胞系(DDP細(xì)胞系)、特級新生小牛血清、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、細(xì)胞裂解液、TRIzolRNA 抽提試劑盒等。其來源統(tǒng)計(jì)，見表1。

方法：①細(xì)胞培養(yǎng)：采用人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1、人胃癌SGC7901 細(xì)胞系、DDP 細(xì)胞系，細(xì)胞株培養(yǎng)在含有10%胎牛血清以及含1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件37℃，含有5%CO2。以下所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均取對數(shù)生長期細(xì)胞。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，隨后按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列來自于南京建成生物工程公司。miR-101的序列為上游引物5'-GGCTCTGAGT- GGTTGAGC-3'、下游引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；cmet的引物序列為上游引物5'-TGAACTGCATACTACGCTCAAGA-3'、下游引物5'-CGGATTCGTCACAATGTGTTC-3'擴(kuò)增條件按照說明書設(shè)置。其后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，計(jì)算3組細(xì)胞系的相對表達(dá)量。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d 以1×106/mL 接種生長至對數(shù)期的胃癌SGC7901細(xì)胞于6孔板，轉(zhuǎn)染前先對細(xì)胞系進(jìn)行饑餓處理1 h，并配備轉(zhuǎn)染溶液(無血清培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒)并置于37℃溫育15 min。將配置好的轉(zhuǎn)染溶液緩慢滴注到6 孔板內(nèi)，輕晃孔板后置于37℃溫育5 h；祛除轉(zhuǎn)染液后，繼續(xù)將細(xì)胞培育于DMEM 液體培養(yǎng)基，孵育條件為5%體積分?jǐn)?shù)的二氧化碳、37℃飽和濕度。比較轉(zhuǎn)染前后DDP細(xì)胞的c-met的相對表達(dá)量。

表1 實(shí)驗(yàn)材料及來源統(tǒng)計(jì)表

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本次研究所有數(shù)據(jù)，均采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)比較χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

3 組 細(xì) 胞 系 的miR-101、c-met 的mRNA 表達(dá)情況：3 組細(xì)胞系的miR-101、c-met 的mRNA 相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，見表2。

轉(zhuǎn)染miR-101 及其抑制劑對胃癌SGC7901 細(xì)胞c-met 的表達(dá)影響：轉(zhuǎn)染miR-101 前、轉(zhuǎn)染miR-101 后及轉(zhuǎn)染miR-101 抑制劑后c-met 的相對表達(dá)量，見圖1。

討 論

胃癌是消化道中最常見的惡性腫瘤之一，其占據(jù)農(nóng)村癌癥發(fā)病率的首位。胃癌惡性程度高，印戒細(xì)胞癌惡性程度尤其高，胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，遠(yuǎn)隔臟器或組織的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的最主要的原因。目前對于胃癌瘤體較大、患者基礎(chǔ)體質(zhì)差而不能耐受手術(shù)或患者不愿手術(shù)治療的患者，多采取化療的治療方式。但在某些患者卻存在對化療藥物耐受的現(xiàn)象，及對其他普通患者有效的化療方案，卻對這些患者的腫瘤不起作用。

表2 3組細(xì)胞系的miR-101、c-met的mRNA相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)表(±s)

表2 3組細(xì)胞系的miR-101、c-met的mRNA相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)表(±s)

細(xì)胞 miR-101 c-met GES1細(xì)胞 1.11±0.04? 1.12±0.08#胃癌SGC7901細(xì)胞 0.62±0.04 1.57±0.10 DDP細(xì)胞 0.35±0.03 2.89±0.32注：GES1細(xì)胞的miR-101表達(dá)量與胃癌SGC7901細(xì)胞、DDP細(xì)胞相比，?P＜0.05，其中與DDP 細(xì)胞相比，P＜0.01；表示GES1 細(xì)胞的c-met 表達(dá)量與胃癌SGC7901 細(xì)胞、DDP 細(xì)胞相比，#P＜0.05，其中與DDP細(xì)胞相比，P＜0.01。

圖1 轉(zhuǎn)染miR-101及其抑制劑對胃癌SGC7901細(xì)胞c-met的表達(dá)影響

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 作為無編碼的短小核苷酸鏈在機(jī)體內(nèi)能起到調(diào)控基因含量與表達(dá)的作用；王莉莉通過RT-qPCR對口腔鱗癌病理組織中的miR-188 表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)[2]，miR-188 在口腔鱗癌組織中表達(dá)量顯著下降。而其他一些miRNA 在腫瘤中的作用也相繼被揭示開來。miR-101 是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤抑制miRNA，在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有類似抑癌基因作用。Guo等人對卵巢癌進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-101(miR-101 mimic)時(shí)發(fā)現(xiàn)[3]，轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞其穿膜細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞增殖率明顯減低，這提示miR-101 在對卵巢癌的增殖及轉(zhuǎn)移方面起著較好的抑制作用。同時(shí)，孫海兵等人通過對比正常人與胃癌患者、胃癌化療耐藥患者的血清miR-101時(shí)發(fā)現(xiàn)[4]，胃癌患者的血清miR-101 明顯低于正常人，而胃癌化療耐藥患者更低。Tian等報(bào)道，替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-101 表達(dá)下調(diào)[5]，過表達(dá)miR-101可通過抑制糖原合成酶激酶3β 逆轉(zhuǎn)替莫唑胺的耐藥性。c-met是一種耐藥性基因，其耐藥機(jī)制主要可能與PI3K信號通路相關(guān)聯(lián)，研究表明抑制c-met表達(dá)可通過阻斷PI3K/Akt通路，增強(qiáng)胃癌對順鉑的敏感性[6]。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜細(xì)胞相比，SGC7901 細(xì)胞系、DDP 細(xì)胞系的miR-101的表達(dá)水平降低，而c-met表達(dá)水平升高，以DDP 細(xì)胞系更顯著(P＜0.01)。隨 后 筆 者 采 用miR-101 對SGC7901 細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，轉(zhuǎn)染處理后SGC7901 細(xì)胞系的c-met 表達(dá)水平隨之降低，再對這些細(xì)胞進(jìn)行miR-101抑制劑處理，結(jié)果c-met 表達(dá)水平升高，且高于正常的SGC7901細(xì)胞系。

綜上所述，miR-101 在人胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，而耐藥性胃癌細(xì)胞表達(dá)水平更低，其低水平表達(dá)能降低對耐藥相關(guān)基因c-met 表達(dá)的抑制而促使胃癌細(xì)胞對化療耐藥。