肖丹丹 蘇秀榮 吳欽泉 宋以玲 路艷艷 陳士更 丁方軍 ，4

1 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部腐植酸類肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 泰安 271600

2 山東農(nóng)大肥業(yè)科技有限公司 泰安 271600

3 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)學(xué)院 泰安 271600

4 土肥資源高效利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 泰安 271600

近年來，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，工業(yè)“三廢”排放量增加，固體廢棄物處理不善，農(nóng)業(yè)自身污染加劇，這些有毒重金屬會(huì)通過植物吸收重金屬經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重威脅人類健康。因重金屬具有毒性強(qiáng)、長期性和非生物降解性，以致土壤重金屬污染成為當(dāng)今嚴(yán)重的環(huán)境問題，鎘（Cd）已被公認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的元素之一[1]。目前我國部分區(qū)域土壤Cd污染問題非常嚴(yán)峻，例如：上海螞蟻浜地區(qū)污染土壤Cd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)21.48 mg/kg，廣州郊區(qū)老污灌區(qū)土壤Cd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)228.00 mg/kg，沈陽張士灌區(qū)一閘土壤Cd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)5.00～76.68 mg/kg[2]。因此，研究重金屬Cd對(duì)植物生理作用的影響具有重要意義[3～6]。

研究發(fā)現(xiàn)，向Cd污染土壤中施入腐植酸（HA），可增強(qiáng)土壤對(duì)重金屬Cd的固定，提高土壤對(duì)重金屬Cd的鈍化作用，減少植物的吸收，阻礙Cd進(jìn)入食物鏈[7]。一方面可能是腐植酸含有大量的羥基、羧基、羰基、甲氧基等官能團(tuán)，能與Cd結(jié)合，形成螯合物和絡(luò)合物等形態(tài)，促使土壤中交換態(tài)Cd向鐵錳氧化物態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)轉(zhuǎn)換，從而降低其生物活性；另一方面，可能是腐植酸影響土壤的其他基本性狀，間接影響土壤Cd有效性；而且腐植酸在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有“改良土壤、增效化肥、刺激生長、增強(qiáng)抗逆、改善品質(zhì)”五大作用。因此，本研究以油菜為材料，研究了腐植酸對(duì)Cd（60 mg/kg）脅迫下油菜體內(nèi)Cd、硝態(tài)氮含量，過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及丙二醛（MDA）含量和超氧陰離子自由基（O2·-）產(chǎn)生速率等生理特性的影響，探討腐植酸緩解重度Cd脅迫的生理機(jī)理，為探明腐植酸緩解植物Cd毒害機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)在山東省泰安市肥城市山東農(nóng)大肥業(yè)科技有限公司試驗(yàn)基地進(jìn)行。供試肥料為普通白粒復(fù)合肥N-P2O5-K2O（24-12-12），由該公司提供。供試土壤為棕壤，取自本公司試驗(yàn)田，其基本理化性質(zhì)：pH 6.34，堿解氮66.37 mg/kg，全氮0.56 g/kg，有效磷21.45 mg/kg，速效鉀33.18 mg/kg，有機(jī)質(zhì)10.81 g/kg，土壤Cd 0.01 mg/kg。供試油菜品種為“華綠一號(hào)”。供試腐植酸由山東創(chuàng)新腐植酸科技股份有限公司提供，其基本理化性質(zhì)：pH 6.7，總腐植酸含量37.1%（濕基），游離腐植酸含量16.9%（濕基），E4/E6=4.7，含水量28%。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)為盆栽試驗(yàn)。在試驗(yàn)田取5～20 cm表層土，晾曬風(fēng)干后過2 mm篩備用。以溶液形式加入CdSO4·10H2O，Cd濃度為60 mg/kg（參照我國部分鎘污染區(qū)域土壤鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)計(jì)），處理濃度分別以純Cd計(jì)。以不加Cd處理作對(duì)照。土壤加入Cd溶液后，充分混勻，保持土壤持水量70%，平衡10天，然后風(fēng)干，分別與不同量的腐植酸混勻后裝盆，每盆盛土3.0 kg。每盆施復(fù)合肥1 g，每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列。各處理詳見表1。

表1 試驗(yàn)處理Tab.1 The experimental treatment

1.3 測(cè)量指標(biāo)及方法

油菜體內(nèi)Cd含量測(cè)定采用GB 5009.15-2014，硝態(tài)氮含量測(cè)定采用紫外吸收法[8]。POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘A470上升0.01為1個(gè)酶活性單位（U），以U/（min·g FW）表示。SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法（NBT），以NBT光化還原被抑制50%的酶液量為1個(gè)酶活性單位，以U/（g FW）表示。CAT活性的測(cè)定采用紫外吸收法，以每分鐘A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活性單位，以U/（min·g FW）表示。MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法。O2·-產(chǎn)生速率的測(cè)定采用羥胺氧化法[9]。

酶液制備：取0.5 g油菜葉片，加入5 mL濃度為0.05 mol/L，pH為7.8的磷酸緩沖液在冰浴下研磨至勻漿，勻漿倒入離心管中，低溫（0～4 ℃）離心20 min，轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘。上清液倒入離心管中，至0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007 軟件進(jìn)行繪圖，用DPS 9.50軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜Cd含量的影響

圖1為不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜Cd含量的影響。由圖可見，與對(duì)照相比，單獨(dú)Cd脅迫條件下，顯著提高了油菜葉片和根系內(nèi)Cd含量，添加不同用量的HA處理均顯著降低了油菜葉片和根系內(nèi)Cd含量，且隨著HA添加量的增加，油菜葉片和根系內(nèi)Cd含量呈現(xiàn)先顯著降低，后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)HA添加量為2 g/kg時(shí)，與單獨(dú)Cd脅迫處理相比，油菜葉片和根系內(nèi)Cd含量分別顯著降低了59.2%和30.9%，且當(dāng)HA添加量高于2 g/kg后，與2 g/kg處理對(duì)比，對(duì)油菜葉片和根系內(nèi)Cd含量無顯著影響。因此，HA添加量達(dá)2 g/kg時(shí)，抑制油菜對(duì)土壤內(nèi)Cd的吸收效果最佳。

2.2 不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)酶活性的影響

植物在生長過程中難免會(huì)遭受生物和非生物逆境脅迫，其代謝過程就會(huì)產(chǎn)生自由基破壞細(xì)胞膜；POD、SOD、CAT作為植物自身的酶保護(hù)系統(tǒng)，可通過各種代謝過程來清除自由基，降低氧化損傷[10]。在一定程度上清除各種逆境因子脅迫下所產(chǎn)生的活性氧，使體內(nèi)活性氧維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，從而有效地阻止過氧化物質(zhì)在植物體內(nèi)積累[11]。表2為不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)酶活性的影響。由表可知，與CK相比，單獨(dú)Cd脅迫條件下，顯著降低了油菜體內(nèi)POD、SOD和CAT活性，表明Cd脅迫下，致使油菜體內(nèi)部分酶失活，從而導(dǎo)致油菜體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡。油菜葉片出現(xiàn)失綠、變黃、葉尖卷曲變干等癥狀時(shí)，表明油菜已經(jīng)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。在Cd脅迫下，施用HA后，油菜體內(nèi)POD、SOD、CAT活性升高，且SOD和POD活性均隨HA添加量的增多而逐漸升高。當(dāng)HA添加量達(dá)到1 g/kg時(shí)，SOD和CAT活性與正常處理相比，無顯著差異，說明添加HA明顯緩解了Cd脅迫對(duì)油菜體內(nèi)POD、SOD和CAT活性的抑制作用，提高了油菜的抗氧化能力，緩解了Cd脅迫造成的氧化損傷，增強(qiáng)了油菜抵抗Cd脅迫的能力。

圖1 不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜Cd含量的影響Fig.1 Effects of different treatments on Cd content in rape under Cd stress

表2 不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)酶活性的影響Tab.2 Effects of different treatments on activities of enzymes in rape under Cd stress

2.3 不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)MDA含量和O2·-產(chǎn)生速率的影響

MDA是在植物器官衰老或逆境條件下，發(fā)生膜脂過氧化作用而產(chǎn)生的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。圖2為不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)MDA含量和O2·-產(chǎn)生速率的影響。由圖可見，Cd脅迫條件下，顯著提高了油菜體內(nèi)MDA含量，添加HA后其含量不斷降低，均與單獨(dú)Cd脅迫處理間存在顯著性差異，且隨HA添加量的增加而逐漸降低。O2·-是植物體內(nèi)的第一個(gè)氧自由基，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧感應(yīng)方面具有重要的作用，濃度適宜時(shí)可作為胞內(nèi)信號(hào)分子，但含量過高時(shí)又會(huì)引起自由基鏈鎖反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)化成H2O2、羥基自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）等自由基，而導(dǎo)致氧化損傷[12]。由圖2可見，Cd脅迫條件下，油菜葉片內(nèi)O2·-產(chǎn)生速率顯著高于CK，添加HA后，O2·-產(chǎn)生速率的變化趨勢(shì)與MDA相似，均隨HA添加量的增多而降低。以上結(jié)果表明，HA可通過提高Cd脅迫下油菜體內(nèi)抗氧化物酶的活性來降低MDA含量和O2·-產(chǎn)生速率，減輕油菜體內(nèi)膜脂過氧化損傷，從而提高油菜的抗逆性。

圖2 不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)MDA含量和O2·-產(chǎn)生速率的影響Fig.2 Effects of different treatments on MDA content and the generation of O2·- in rape under Cd stress

2.4 不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)硝態(tài)氮含量的影響

硝態(tài)氮是植物的重要氮源，植物體內(nèi)硝態(tài)氮含量可以反映土壤氮素供應(yīng)情況。特別是葉菜類和根菜類蔬菜中常含有大量硝酸鹽，在烹飪和腌制過程中可轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽而危害健康。因此，硝酸鹽含量高低是衡量蔬菜品質(zhì)、安全性的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)能夠反映作物的氮素營養(yǎng)狀況[13]。圖3為不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)硝態(tài)氮含量的影響。由圖可見，單獨(dú)Cd脅迫條件下，油菜體內(nèi)硝態(tài)氮含量明顯升高，但差異不顯著，而隨著HA添加量的增加，油菜葉片內(nèi)硝態(tài)氮含量顯著降低，且低于對(duì)照處理，差異達(dá)顯著水平。說明HA對(duì)降低Cd脅迫下油菜體內(nèi)硝態(tài)氮的形成和累積有很好的效果，且低于非Cd脅迫下油菜體內(nèi)硝態(tài)氮的含量。

圖3 不同處理對(duì)Cd脅迫下油菜體內(nèi)硝態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on nitrate nitrogen content in rape under Cd stress

3 討論與結(jié)論

張樹杰等[14]認(rèn)為Cd脅迫顯著抑制了油菜幼苗的生長，植株根系和地上部干重隨著Cd濃度的升高而顯著降低；同時(shí)，油菜幼苗體內(nèi)抗氧化酶（POD、SOD和CAT）活性在高濃度Cd脅迫時(shí)顯著降低。劉麗莉等[15]研究表明，Cd脅迫濃度達(dá)到600 μmol/L時(shí)，顯著提高了油菜體內(nèi)MDA含量，降低了SOD和CAT活性，從而降低了油菜抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)的功能，加劇了膜系統(tǒng)的氧化損傷。

任學(xué)軍等[16，17]研究表明，HA能明顯降低小麥幼苗體內(nèi)Cd含量；能顯著降低Cd污染土壤種植小白菜體內(nèi)重金屬Cd的積累量，且對(duì)重金屬Cd積累的抑制效應(yīng)隨HA添加量的增多而逐漸增強(qiáng)，并獲得了最佳的添加范圍，即1.0～2.0 g/kg。彭正萍等[18]研究認(rèn)為，HA能顯著降低油菜體內(nèi)硝酸鹽含量，提高Vc、可溶性糖含量以及POD和SOD活性。本研究與以上研究結(jié)論基本一致，具體為：在Cd脅迫下，添加不同用量HA，油菜體內(nèi)Cd含量隨HA添加量的增加而降低，HA最佳添加量為2 g/kg；土壤中添加HA后降低了油菜體內(nèi)硝態(tài)氮含量，提高了POD、SOD和CAT活性，降低了MDA含量和O2·-產(chǎn)生速率，促使油菜抗氧化酶系統(tǒng)恢復(fù)平衡、膜脂過氧化得到緩解。因此，在Cd含量較低，污染程度輕的土壤上有望通過添加一定用量的HA來降低Cd在作物體內(nèi)的累積，以達(dá)到食物所要求的最低檢出限，提高產(chǎn)品安全性。但仍需針對(duì)不同程度Cd污染土壤、不同作物以及腐植酸產(chǎn)品種類和用量等做相關(guān)研究。