谷端銀 高俊杰 焦 娟 劉中良 閆偉強

泰安市農(nóng)業(yè)科學研究院 泰安 271018

碳、氮代謝是植物體內(nèi)最基本的兩大代謝過程，氮素的高低直接或間接地影響植物的碳代謝[1]。

碳代謝主要通過光合作用、呼吸作用及糖類代謝等途徑影響作物的生長發(fā)育、有機化合物的合成、轉運和積累，進而影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。設施蔬菜生產(chǎn)因過量施肥導致NO3-積累，從而引起連作障礙，對作物生長和發(fā)育帶來了諸多不利影響。脅迫下，種子萌發(fā)受到抑制[2]，植株抗氧化物酶系統(tǒng)紊亂[3]，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加，植物生長受到抑制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

純化腐植酸（PHA）為風化煤腐植酸純化后獲得，具體方法參考國際腐殖質(zhì)學會（International Humic Substances Society，IHSS；http://www.ihss.gatech.edu/soilhafa.html）及Aguirre等[9]的方法。

供試品種為“新泰密刺”黃瓜。挑選飽滿度均勻的種子，采用溫湯浸種、催芽后，挑選發(fā)芽整齊的種子播于裝有基質(zhì)（草炭∶蛭石=2∶l）的穴盤中，待第一片真葉展平時，選取生長一致的幼苗，洗凈黃瓜幼苗根部基質(zhì)，以聚乙烯泡沫板打孔固定植株，移栽至盛有6 L營養(yǎng)液的水培盆（40 cm×30 cm×12 cm）中，每盆定植6株，采用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每3天更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)至3葉1心時進行處理。

試驗設3個NO3-水平：正常氮水平（NO3-為11 mmol/L，對照）、低氮脅迫（NO3-為 1 mmol/L）和高氮脅迫（NO3-為101 mmol/L）；2個PHA水平：即0和100 mg/L（總腐植酸含量）。共計6個處理，分別記為MN（對照）、LN（低氮脅迫）、HN（高氮脅迫）、MN+P（對照添加PHA）、LN+P（低氮脅迫添加PHA）、HN+P（高氮脅迫添加PHA）。

為避免PHA在營養(yǎng)液中與Ca2+產(chǎn)生絮凝，影響處理效果，Ca2+濃度控制在0.5 mmol/L以下。低氮脅迫營養(yǎng)液采用基礎營養(yǎng)液（NO3-為1 mmol/L），基礎營養(yǎng)液配方參考Mina等[10]略作修改，為1 mmol/L NO3-[由0.5 mmol/L Ca(NO3)2提供]，0.75 mmol/L K2SO4，0.65 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L KH2PO4，50 μmol/L KCl，40 μmol/L H3BO3，4 μmol/L MnSO4，2 μmol/L CuSO4，2 μmol/L ZnSO4，1.4 μmol/L (NH4)2MoO4，40 μmol/L EDDHA-Fe（乙二胺鄰二羥基乙酸鐵），以濃H2SO4調(diào)整營養(yǎng)液pH 5.5～6.5。對照營養(yǎng)液，即在基礎營養(yǎng)液中另加10 mmol/L此10 mmol/L NO3-由硝酸鉀∶硝酸銨∶硝酸鈉=1∶0.5∶0.5提供。高氮脅迫營養(yǎng)液，在基礎營養(yǎng)液中另加100 mmol/L NO-，此100 mmol/L3由硝酸鉀∶硝酸銨∶硝酸鈉=1∶0.5∶0.5提供。

在PHA使用前，先配制成5.0 g/L PHA鹽母液，根據(jù)所需濃度在處理第1天即按照所需濃度加入到處理營養(yǎng)液中。脅迫處理開始時，對照和低氮脅迫第1天全部加入。高氮脅迫處理為防止高濃度一次性加入的鹽刺激，于第1、2、3天各加入1/3的NO-濃度，第4天各處理全部更換一次對應NO-33處理濃度的營養(yǎng)液，3天后再更換1次對應NO-3處理濃度的營養(yǎng)液。每個處理3次重復。生理生化指標測定于第2次更換營養(yǎng)液的次日上午取樣。

1.2 試驗方法

1.2.1 PHA的基礎指標測定

PHA的元素組成采用Elementar Analysensysteme GmbH元素分析儀（varioMICRO V1.5.4 2007-9-27，CHNS Mode，Ser.No.：15072029）測定。PHA分子量測定：采用激光光散射-凝膠滲透色譜儀（Wyatt DAWN HELEOS-Ⅱ），分子排阻色譜法測定。光散射檢測器為Wyatt DAWN HELEOS-Ⅱ（紅色信號）；示差檢測器為Wyatt Optilab（藍色信號）；色譜柱：Shodex SB-806M，Shodex SB-G保護柱；色譜條件：流動相為0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液；柱溫為45 ℃；流速為0.5 mL/min。E4/E6的測定采用分光光度計法，即在465和665 nm處分別測定吸光度，記為E4和E6值，并計算E4/E6值，具體參見谷端銀等[10]的方法。PHA的基礎指標詳見表1。

表1 PHA分子量、元素含量、原子比例及E4/E6Tab.1 Molecular weight, element content, atomic ratios and E4/E6 of PHA

1.2.2 測定項目與方法

參照趙世杰[11]的方法測定光合色素含量及可溶性糖含量；參照寧宇等[12]的方法測定蔗糖合酶（SS）、磷酸蔗糖合酶（SPS）活性；采用Elisa試劑盒說明書的指導方法測定1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）活性（試劑盒由上海邦奕生物科技有限公司提供）。以上每個指標均重復測定3次，取平均值和標準差進行數(shù)據(jù)分析。

氣體交換參數(shù)的測定：用Li-6400型便攜式光合作用測定系統(tǒng)（美國基因公司生產(chǎn)）于晴天上午9：00～11：00，測定頂端展開的第3片功能葉凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr），測定時光強約為800 μmol/m2·s，溫度為30 ℃，空氣中CO2濃度為（400±10）μmol/mol，每個處理隨機選取5株黃瓜幼苗進行測定。水分利用效率（WUE）=Pn/Tr；氣孔限制值（Ls）=1-Ci/Ca（Ca為大氣中CO2的濃度）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用DPS 7.55軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗葉片光合色素含量的影響

由表2可知，與對照相比，低氮、高氮脅迫處理的黃瓜幼苗光合色素含量（葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量）均有所降低，其中葉綠素a、類胡蘿卜素及葉綠素（a+b）含量各處理間差異達顯著水平。對照添加PHA處理與未添加處理相比，葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量及葉綠素（a+b）含量均顯著增加。與對照比，低氮脅迫處理葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量及葉綠素（a+b）含量略有增加但差異不顯著，而高氮脅迫處理均顯著增加。無論是否添加PHA，葉綠素a/b均在低氮脅迫下最大，添加PHA與未添加處理相比，低氮、高氮脅迫下比值增大，且均高于對照，但差異不顯著。

表2 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗葉片光合色素含量的影響Tab.2 Effects of PHA on photosynthetic pigment content of cucumber seedling leaves under nitrogen stress

2.2 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗葉片RuBPCase活性的影響

由圖1可知，與對照相比，低氮、高氮脅迫處理的葉片RuBPCase活性均顯著降低。對照、低氮脅迫下，添加PHA比未添加處理RuBPCase活性均顯著提高；但高氮脅迫下RuBPCase活性顯著降低。添加PHA處理RuBPCase活性以對照活性最高，而高氮脅迫處理活性最低。

圖1 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗葉片RuBPCase活性的影響Fig.1 Effects of PHA on RuBPCase activity of cucumber seedling leaves under nitrogen stress

2.3 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗葉片氣體交換參數(shù)的影響

由表3可知，與對照相比，低氮、高氮脅迫處理的黃瓜葉片Pn均降低，3個處理間差異顯著，以高氮脅迫處理黃瓜幼苗Pn最低。對照添加PHA后，Pn顯著提高，低氮脅迫處理呈現(xiàn)相同趨勢，而高氮脅迫處理略有降低，但差異不顯著。說明添加PHA的低氮脅迫處理、對照可提高Pn，但高氮脅迫下PHA對Pn無顯著促進作用。

與對照相比，低氮、高氮脅迫處理的黃瓜葉片Gs均降低，3個處理間差異顯著，以高氮脅迫處理黃瓜幼苗Gs最低。對照添加PHA后，黃瓜幼苗Gs顯著提高，在低氮、高氮脅迫下添加PHA，黃瓜幼苗Gs也提高，其中低氮脅迫下差異達顯著水平，而高氮脅迫下差異不顯著。說明添加PHA的低氮脅迫處理、對照可提高Gs，但高氮脅迫下PHA對Gs無顯著促進作用。

與對照相比，低氮脅迫下黃瓜葉片Ci無顯著差異，高氮脅迫下葉片Ci顯著降低。各處理添加PHA后與未添加對應處理相比，Ci值均降低，其中，對照降低顯著。說明添加PHA可降低Ci，對照表現(xiàn)差異顯著。

與對照相比，低氮、高氮脅迫處理的黃瓜葉片Tr顯著降低，以高氮脅迫下黃瓜葉片Tr最低。對照添加PHA比未添加處理Tr降低，差異達顯著水平；而低氮脅迫下，黃瓜葉片Tr顯著提高；高氮脅迫下，黃瓜葉片Tr顯著降低。添加PHA后，低氮脅迫與對照間差異不顯著，與高氮脅迫處理差異顯著。說明添加PHA后在不同氮水平下，Tr表現(xiàn)不同，對照、高氮脅迫下顯著降低，低氮脅迫下則相反。

表3 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗葉片氣體交換參數(shù)的影響Tab.3 Effects of PHA on gas exchange parameters of cucumber seedling leaves under nitrogen stress

2.4 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗葉片Ls及WUE的影響

由圖2可以看出，與對照相比，低氮脅迫下黃瓜葉片Ls無顯著差異，而高氮脅迫下顯著增大。添加PHA的Ls均比未添加處理顯著增大；低氮脅迫與對照間Ls無顯著差異，但Pn顯著不同，可能因為RuBPCase活性不同或光化學活性不同所致；而高氮下Ls顯著增高，可能是其Pn顯著降低的原因之一。

由圖2可知，與對照相比，低氮脅迫黃瓜葉片WUE無顯著差異，而高氮脅迫下WUE顯著增大。添加PHA與未添加處理相比，低氮脅迫、對照的WUE略有升高，差異不顯著；而高氮脅迫下，添加PHA后，WUE提高，且差異達顯著性水平。高氮脅迫下WUE最大，可能主要因為顯著降低的Tr所致。

圖2 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗葉片Ls和WUE的影響Fig.2 Effects of PHA on Ls and WUE of cucumber seedling leaves under nitrogen stress

2.5 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗可溶性糖含量的影響

由圖3可知，與對照相比，低氮、高氮脅迫下黃瓜根系和葉片大量積累可溶性糖，尤其是低氮脅迫下，顯著高于其他處理。添加PHA使黃瓜根系及葉片可溶性糖含量均呈增加趨勢。

添加PHA對對照根系中可溶性糖含量影響不顯著。而低氮、高氮脅迫下，添加PHA與未添加處理相比可溶性糖含量分別提高了32.3%、19.3%，差異顯著。添加PHA使對照葉片中可溶性糖含量提高5.3%；低氮脅迫下含量提高16.7%，高氮脅迫下含量提高8.4%，差異均顯著。

低氮脅迫下，植株形成相對較大的葉面積，產(chǎn)生大量光合產(chǎn)物，可溶性糖向根系大量的運輸既有利于根系生長（低氮脅迫下兩處理根冠比最大），又可為氮吸收同化提供充足的能量和碳架。高氮脅迫下，氮素同化與碳水化合物合成發(fā)生明顯競爭性抑制，奢侈吸收的氮素被轉化成蛋白質(zhì)，積累相對較少，從而減少了向根系分配碳水化合物的數(shù)量。同時，高氮脅迫意味著較多的鹽基逆境，可溶性糖積累相應增多，也是植株自身調(diào)節(jié)、提高抗逆性的表現(xiàn)。一方面，PHA可能是因為刺激黃瓜幼苗生長間接促成可溶性糖的積累；另一方面，PHA也有可能作為生物刺激素直接促進可溶性糖的合成。

圖3 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗可溶性糖含量的影響Fig.3 Effects of PHA on soluble sugar content of cucumber seedlings under nitrogen stress

2.6 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗SPS和SS活性的影響

由圖4可知，根系中，與對照相比，低氮脅迫下SPS活性顯著提高，而高氮脅迫下SPS活性顯著降低。對照添加PHA處理使SPS活性顯著降低；低氮脅迫下添加PHA處理SPS活性也顯著降低；高氮脅迫下添加PHA處理反而使SPS活性顯著升高（39.3%）。

葉片中，與對照相比，低氮、高氮脅迫下SPS活性均顯著降低；對照添加PHA處理SPS活性顯著降低；低氮、高氮脅迫下，添加PHA處理SPS活性顯著提高，這也可能是葉片中對應低氮、高氮脅迫下可溶性糖含量較高的原因。

由圖4還可看出，根系中，與對照相比，高氮脅迫下SS活性降低，低氮脅迫下幾乎無變化，而高氮脅迫下差異達顯著水平；對照添加PHA處理對SS活性影響不顯著；低氮、高氮脅迫下，添加PHA處理SS活性均顯著提高。

葉片中，與對照相比，低氮、高氮脅迫下使SS活性顯著升高；對照添加PHA處理SS活性顯著升高；在低氮和高氮脅迫下，添加PHA處理SS活性顯著降低，這可能是葉片中較高含量的可溶性糖含量反饋抑制了SS活性。

圖4 PHA對氮脅迫下黃瓜幼苗SPS及SS活性的影響Fig.4 Effects of PHA on SPS and SS activity of cucumber seedlings under nitrogen stress

3 討論

設施蔬菜生產(chǎn)中過量施肥現(xiàn)象目前仍較為普遍，設施土壤中硝酸鹽積累是造成設施土壤次生鹽漬化的主要原因之一[13，14]。輪作、增施有機肥及使用緩釋肥等途徑可緩解土壤中硝酸鹽積累對蔬菜生長的影響，而近年來通過腐植酸提高蔬菜抗逆性的應用和研究也越來越多[4，5]。

植物葉片中的氮大部分以酶的形式存在于葉綠體和線粒體中[15]，氮肥的施用除了直接影響植物的生長及氮代謝過程外，還會影響到植物的光合作用。本試驗結果顯示，與對照相比，低氮脅迫、高氮脅迫下Pn顯著降低，尤其是高氮脅迫下Pn降低幅度較大；添加PHA后，低氮脅迫、對照的Pn顯著增加，但高氮脅迫下Pn無顯著變化；添加PHA顯著促進了類胡蘿卜素含量的增加，而類胡蘿卜素可以猝滅三線態(tài)葉綠素和清除脅迫條件下的氧自由基，進而避免對光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）反應中心的直接破壞[16]。在低氮和高氮脅迫下，添加PHA也使葉綠素a/b值升高，有利于增強Pn[17]。

腐植酸可以調(diào)節(jié)氣孔的開閉進而調(diào)節(jié)光合作用，提高植物的抗逆性。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的腐植酸（黃腐酸）均可抑制氣孔開啟、抑制K+在保衛(wèi)細胞中的積累，類似脫落酸（ABA）的作用，腐植酸使用濃度以100 ppm為宜，并發(fā)現(xiàn)在pH值為5時所得的腐植酸抑制作用最大[18]。有研究者發(fā)現(xiàn)，從蚯蚓糞中提取的腐植酸與生長素（IAA）一樣，通過活化磷脂酶A2誘導了氣孔開放，而不是通過殼梭孢素及光照誘導的信號途徑完成[19]。腐植酸浸種提高了Gs，降低了Ci，通過緩解葉肉細胞光合系統(tǒng)的損傷，調(diào)節(jié)氣孔等因素而提高了鹽堿脅迫下小麥的Pn[20]。

本研究結果顯示，低氮脅迫、對照在添加PHA后，提高Gs，這有利于CO2快速同化、蒸騰作用加強和Pn提高；Ci降低，Pn升高，這可能與RuBPCase活性提高有關；而高氮脅迫下，RuBPCase活性降低，Ls增大，誘導氣孔關閉，Gs降低，Tr降低，Pn降低，但WUE增大。

綜上所述，氮脅迫下，PHA增加了光合色素含量、Pn、Ls，提高了WUE、根系及葉片SPS活性、根系SS活性，從而提高了黃瓜根系及葉片中可溶性糖含量，有效緩解了氮脅迫對黃瓜幼苗的影響，促進了黃瓜幼苗光合及碳代謝進程。