趙 會(huì)，章紹兵

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

水酶法提油是在機(jī)械破碎的基礎(chǔ)上，采用纖維素酶、蛋白酶等對(duì)油料種子進(jìn)行酶解，最終得到油脂和具有特定功能水解蛋白的過(guò)程[1-2]。目前水酶法工藝得到的花生蛋白水解液中，多含有大量的可溶性糖、鹽和其他物質(zhì)，為了得到高純度的水解蛋白，必須進(jìn)行純化處理。但水解蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較小，無(wú)法通過(guò)酸沉的方法與其他可溶性糖類分開(kāi)。而其他水解蛋白純化方法如大孔樹(shù)脂吸附、納濾等大多操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的擴(kuò)大應(yīng)用[3-4]。

花生蛋白在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，易形成沉淀?；ㄉ锌扇苄蕴侵饕姓崽恰⑵咸烟?、果糖等，單糖分子中有多個(gè)羥基，增加了其水溶性，尤其在熱水中溶解度大，而多糖是多元醇，每個(gè)糖單位都有結(jié)合水分子的能力，因此多糖具有較強(qiáng)的親水性，在水溶液中多糖顆粒吸水膨脹，然后部分溶解或完全溶解[5]。利用此原理，本文在花生酶解前設(shè)計(jì)了酸浸環(huán)節(jié)，旨在酶解前除去大部分可溶性糖和其他雜質(zhì)而將蛋白質(zhì)保留在沉淀中，之后再利用蛋白酶水解乳狀液和沉淀，最終可同時(shí)獲得花生油和純化的水解蛋白。本文研究了酸浸過(guò)程中影響可溶性糖脫除率和蛋白質(zhì)損失率的主要因素，優(yōu)化得到了水酶法加工花生過(guò)程中酸浸工藝的最佳條件，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

花生：市售，脂肪含量52.18%，蛋白質(zhì)含量27.8%，可溶性糖含量(10.79±0.15)%，水分含量3.47%。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、濃硫酸、蒸餾水等。

1.1.2 儀器與設(shè)備

722-G可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；FE20 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；SHA-C水浴振蕩器，鞏義市予華儀器有限公司； DT5-4B離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；KDN-1凱氏定氮儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸浸工藝

將花生在190℃烘烤20 min，每隔5 min取出翻一次。將花生去皮之后充分粉碎成漿狀，取30 g花生漿于燒杯中，以適當(dāng)比例加入蒸餾水，攪拌均勻，使花生漿充分溶于水，調(diào)pH，在一定溫度的水浴振蕩器中進(jìn)行酸處理，然后離心得到酸浸溶液，測(cè)定其中可溶性糖含量及蛋白質(zhì)含量。分別考察料液比、pH、處理時(shí)間、溫度對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響。

1.2.2 可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率計(jì)算

可溶性糖脫除率= 酸浸溶液中可溶性糖含量/花生中可溶性糖總量×100%

蛋白質(zhì)損失率= 酸浸溶液中蛋白質(zhì)含量/花生中蛋白質(zhì)總量×100%

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2010。

1.2.4 可溶性糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[6-7]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取7支具塞刻度試管，按順序分別加入不同體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水、苯酚和濃硫酸。將各試管搖勻，在室溫放置30 min后，在分光光度計(jì)上進(jìn)行比色。調(diào)波長(zhǎng)為490 nm，用0號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，分別測(cè)出1～7號(hào)管的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶液中可溶性糖含量的測(cè)定：取1 mL酸浸溶液定溶于100 mL容量瓶中，混勻。吸取已定容的樣品0.6 mL置于25 mL比色管中，以蒸餾水補(bǔ)至2 mL，依次加入苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，混勻，在室溫放置30 min后，于490 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。然后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其可溶性糖含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以兩次以上結(jié)果的平均值表示，并使用SPSS 16.0 for Windows軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

控制體系料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，在溫度50℃、pH 4.5條件下處理90 min后離心，測(cè)定可溶性糖脫除率與蛋白質(zhì)損失率。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

從圖1可以看出，隨著水用量的增加，可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都呈明顯增加趨勢(shì)。對(duì)于可溶性糖，增加水用量的同時(shí)，多糖中羥基、環(huán)氧原子以及連接糖環(huán)的糖苷氧原子與水結(jié)合的機(jī)會(huì)也隨之增多，當(dāng)料液比超過(guò)1∶5以后，再增加水用量，可溶性糖脫除率增加幅度減緩。同時(shí)，繼續(xù)增加水用量會(huì)增加蛋白質(zhì)的損失。盡管酸浸的pH處在花生蛋白的等電點(diǎn)附近，但仍然會(huì)有少量蛋白質(zhì)不會(huì)沉淀，隨著水用量的增加，酸浸溶液中可溶性蛋白質(zhì)的量也將增加。

2.1.2 pH對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

控制體系pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，在料液比1∶5、溫度50℃條件下處理90 min后離心，測(cè)定可溶性糖脫除率與蛋白質(zhì)損失率。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

從圖2可以看出，隨著pH的增加，可溶性糖脫除率變化并不顯著。而對(duì)于蛋白質(zhì)，在pH為4.5和5時(shí)損失率最低，這說(shuō)明花生蛋白的等電點(diǎn)應(yīng)在此附近。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零，缺乏靜電推斥作用，因而疏水相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集和沉淀，溶解度最小[8]。

2.1.3 處理時(shí)間對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

在料液比1∶5、pH 5、溫度50℃條件下分別處理0、15、30、45、60 min后離心，測(cè)定可溶性糖脫除率與蛋白質(zhì)損失率。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 處理時(shí)間對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

從圖3可以看出，可溶性糖脫除率和蛋白質(zhì)損失率都隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，30 min以前上升較快，30 min以后趨于平緩。對(duì)于可溶性糖，剛開(kāi)始時(shí)，多糖中羥基、環(huán)氧原子以及糖苷氧原子等與水快速形成氫鍵，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合速度減慢，可溶性糖脫除率趨于平緩。對(duì)于蛋白質(zhì)，30 min以前，蛋白質(zhì)-水相互作用顯著，使蛋白質(zhì)溶解量快速增加，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水相互作用逐漸達(dá)到平衡，蛋白質(zhì)損失率趨于平緩[9]。

2.1.4 溫度對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

控制體系溫度分別為30、40、50、60、70℃，在料液比1∶5、pH 5條件下處理30 min后離心，測(cè)定可溶性糖脫除率與蛋白質(zhì)損失率。結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可以看出，隨著溫度的升高，可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都呈上升趨勢(shì)。對(duì)于可溶性糖脫除率，40℃之前快速增長(zhǎng)，40℃之后增長(zhǎng)緩慢。對(duì)于可溶性糖，升溫可能破壞了多糖分子間的氫鍵，從而增加多糖與水之間形成氫鍵的機(jī)會(huì)，同時(shí)，分子做無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)的快慢與溫度有關(guān)，升溫能加快水分子運(yùn)動(dòng)速度，也能加快多糖與水、蛋白質(zhì)與水的接觸機(jī)會(huì)，從而加快了可溶性糖及蛋白質(zhì)的溶解速率[10]。

圖4 溫度對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以可溶性糖脫除率和蛋白質(zhì)損失率為考察指標(biāo)，選取料液比、pH、處理時(shí)間、溫度進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)?；ㄉ峤に嚨恼辉囼?yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3、表4。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 可溶性糖脫除率方差分析

表4 蛋白質(zhì)損失率方差分析

由表2可知，影響可溶性糖脫除率因素的主次順序?yàn)榱弦罕?溫度>pH>處理時(shí)間，最佳工藝組合為A3B1C2D3。由表3可知，對(duì)于可溶性糖脫除率，料液比具有極顯著影響，溫度具有顯著影響，處理時(shí)間和pH影響不顯著。由表2可知，影響蛋白質(zhì)損失率因素的主次順序?yàn)闇囟?料液比>pH>處理時(shí)間，最佳工藝組合為A1B2C1D2。由表4可知，對(duì)于蛋白質(zhì)損失率，料液比、pH、溫度具有極顯著影響，處理時(shí)間具有顯著影響。

從極差值和方差分析可以看出，對(duì)于可溶性糖，影響最大的是料液比，因此料液比選擇1∶6，pH對(duì)蛋白質(zhì)損失率有較大影響，選擇pH為5，溫度對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都有較大影響，但因?yàn)榈鞍踪|(zhì)損失很少，所以首先考慮對(duì)可溶性糖脫除率的影響，即溫度選擇50℃，處理時(shí)間對(duì)兩者影響均較小，選擇處理時(shí)間為30 min。綜合考慮，酸浸工藝的最佳條件為A3B2C2D3，即料液比 1∶6、處理時(shí)間30 min、pH 5、溫度50℃。在最佳條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，可溶性糖脫除率為(83.11±0.33)%，蛋白質(zhì)損失率為(6.19±0.13)%。

3 結(jié) 論

(1)料液比對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都具有極顯著影響，隨著水用量的增加，可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都呈上升趨勢(shì)；pH對(duì)可溶性糖脫除率影響不顯著，但對(duì)蛋白質(zhì)損失率具有極顯著影響；處理時(shí)間對(duì)可溶性糖脫除率影響不顯著，但對(duì)蛋白質(zhì)損失率具有顯著影響；溫度對(duì)可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率有顯著或極顯著影響，隨著溫度的升高，可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都呈上升趨勢(shì)。

(2)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酸浸過(guò)程，確定酸浸工藝最佳條件為料液比 1∶6、處理時(shí)間30 min、pH 5、溫度50℃，此條件下可溶性糖脫除率為(83.11±0.33)%，蛋白質(zhì)損失率為(6.19±0.13)%。酸浸處理花生后可顯著減少花生蛋白中糖的含量，但同時(shí)也伴有少量蛋白質(zhì)損失。