（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院河南新鄉(xiāng)453007）

草魚 (Ctenopharyngodon idellus)是四大家魚之一，肉質(zhì)鮮美，經(jīng)檢測含有大量的不飽和脂肪酸，有利于人體血液循環(huán)，因此是廣大消費(fèi)者餐桌上較常見的魚類之一；其次，草魚個(gè)體較大，生長迅速，是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類[1]。但由于近年來草魚的養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖地區(qū)的不斷擴(kuò)大以及生態(tài)環(huán)境的惡化，草魚因感染細(xì)菌性病原而致病的事例逐漸增多[2]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)屬于弧菌科，氣單胞菌屬，能從自然水體、土壤和魚體中分離檢測到，是水產(chǎn)動(dòng)物的條件致病菌，在魚體抵抗力下降或者環(huán)境條件惡劣時(shí)感染魚類可導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punetaus）套腸病、腹水病，淡水養(yǎng)殖魚類患危害性較大的細(xì)菌性敗血癥，中華鱉（Trionyx sinensis）患紅底板病、腐皮病等[3-7]，也能感染鳥類、爬行類和兩棲類動(dòng)物致使其出現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀[8]。在一定條件下，人類感染嗜水氣單胞菌后，出現(xiàn)腹瀉、腸炎等疾病，嚴(yán)重者導(dǎo)致敗血癥[9]。嗜水氣單胞菌為目前普遍存在的一種人-畜-水生動(dòng)物共患病原菌[10]。2017年5月份，新鄉(xiāng)郊區(qū)某漁場養(yǎng)殖的草魚出現(xiàn)腹部膨大，紅腫出血等癥狀，為查明該漁場草魚死亡原因，本實(shí)驗(yàn)對分離純化的病原菌進(jìn)行了形態(tài)觀察、人工感染、gyrB基因鑒定以及藥敏試驗(yàn)，旨在為草魚感染細(xì)菌性疾病的科學(xué)防控提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

本研究所用患病草魚魚體質(zhì)量為84-96 g，體長14-16 cm，取自新鄉(xiāng)郊區(qū)某養(yǎng)殖場，發(fā)病癥狀表現(xiàn)為鰓絲末端腐爛，腹部膨大，肝脾糜爛。

供試鯽魚（Carasstus anratus）取自河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，魚體質(zhì)量為18-24 g，體長10-11 cm。選取體質(zhì)健康的個(gè)體用于人工感染實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)菌分離鑒定

1.2.1 細(xì)菌分離

在無菌條件下使用接種環(huán)蘸取發(fā)病草魚的脾臟、肝臟等組織，分別劃線接種于TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，選取代表性菌株AH-16進(jìn)行常規(guī)革蘭氏染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察分離菌株的染色特性。

1.2.2 人工感染

供試鯽魚暫養(yǎng)7天，挑選體質(zhì)健康的50尾個(gè)體，將其隨機(jī)分為5組，放在直徑為60 cm、深度為100 cm的圓桶里，水溫保持在25±1℃，不喂食，每天換1/3水。將分離菌株AH-16按照等對數(shù)間距設(shè)置實(shí)驗(yàn)濃度梯度，配制成7.90×107cfu/mL、1.96×107cfu/mL、4.94×106cfu/mL、1.24×106cfu/mL 4個(gè)梯度的菌懸液，按200 μL/尾的劑量分別對供試鯽魚進(jìn)行腹腔注射，腹腔注射200 μL的無菌生理鹽水，攻毒后定時(shí)查看鯽魚的存活情況以及做好記錄，飼養(yǎng)觀察2周。并根據(jù)攻毒后不同濃度菌懸液下的死亡情況，計(jì)算死亡率，且該病原菌的半致死濃度LD50值參照半數(shù)效量累積法（Reed-Muench法）[11]進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 gyrB基因的PCR擴(kuò)增

使用CTAB法提取純化細(xì)菌的基因組DNA[12]，PCR擴(kuò)增所用引物gyrB-F：5'－TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3'，gyrB-R：5'-TTTCCGGGTTGTACTCGTC-3'。反應(yīng)體系：2×Es Mix 10 μL、DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、添加ddw 至20 μL。PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，72℃終延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)特異性良好的目的條帶，將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測序把測序結(jié)果進(jìn)行BLAST搜索，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 藥敏試驗(yàn)

選用阿莫西林、羅紅霉素、奈啶酸、復(fù)方新諾明、頭孢噻肟、妥布霉素等22種抗菌藥物，藥敏試驗(yàn)按照常規(guī)紙片擴(kuò)散（K-B）法進(jìn)行操作[13]，首先制備優(yōu)勢菌株AH-16的菌懸液，向菌懸液中加入經(jīng)高溫滅菌的生理鹽水稀釋為1×108cfu/mL，然后吸取100 μL稀釋后的菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平板，把藥敏紙片分別貼到經(jīng)自然晾干的培養(yǎng)基上，每一個(gè)平板貼3片相同的藥敏紙片，28℃恒溫過夜培養(yǎng)，測量抑菌圈的直徑，結(jié)果取3個(gè)數(shù)值的平均數(shù)。分離菌株的藥敏紙片結(jié)果分析參照文獻(xiàn)[14-15]中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 分離菌的特征

從患病草魚體內(nèi)分離的細(xì)菌接種到TSA培養(yǎng)基上經(jīng)過純化培養(yǎng)后獲得一批形態(tài)一致的優(yōu)勢菌，菌落形態(tài)為卵圓形、邊緣光滑、乳白色，中央隆起（圖1）。革蘭氏染色陰性，呈短桿狀，兩端鈍圓，排列形式為單個(gè)或多個(gè)，細(xì)菌大小長約1-2 μm（圖2）。

2.1.2 人工感染

圖1 分離菌株AH-16的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated strain AH-16

圖2 分離的菌株AH-16的革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram staining results of isolated strainAH-16

將配制好的不同濃度的菌懸液對健康鯽魚進(jìn)行腹腔注射后，鯽魚的死亡情況詳見表1，結(jié)果顯示，菌懸液濃度為7.90×107cfu/mL實(shí)驗(yàn)組的鯽魚48 h內(nèi)死亡率達(dá)100%，死亡鯽魚發(fā)病癥狀與新鄉(xiāng)郊區(qū)某養(yǎng)殖場自然發(fā)病的草魚的癥狀類似，主要表現(xiàn)為鰓絲末端腐爛，腹部膨脹，胸部出血，肝脾糜爛。1.96×107cfu/mL濃度組的鯽魚48 h內(nèi)死亡率為80%；菌懸液濃度為4.94×106cfu/mL和1.24×106cfu/mL實(shí)驗(yàn)組中，鯽魚在48 h內(nèi)均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；對照組在48 h內(nèi)全部沒有死亡。使用Reed-Muench法計(jì)算出分離菌AH-16對鯽魚的LD50為1.2×107cfu/mL。

表1 鯽魚的人工感染試驗(yàn)Table 1 Artificial infection test of healthy Crucian carp

2.1.3 gyrB基因的PCR擴(kuò)增

分離菌株AH-16的PCR檢測結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，PCR擴(kuò)增獲得了大小約為1100 bp的目的基因，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。將測序結(jié)果進(jìn)行Blast搜索，使用MEGA 6.0建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果顯示分離菌株AH-16與嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(HQ326180.1)的同源相似度為99%，嗜水氣單胞菌和分離菌株AH-16在系統(tǒng)進(jìn)化樹中聚為一支，則該致病菌AH-16為嗜水氣單胞菌。

圖3 分離菌株AH-16的PCR檢測結(jié)果注：M為DL5000 Marker;1為分離菌株的PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection results of isolated strain AH-16Note:M is DL 5000 Marker;1 is the PCR detection result of the isolated strain

圖4 分離菌株AH-16的gyrB基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Syetematic phylogenetic tree of gyrB gene sequence of isolated strain AH-16

2.2 藥敏試驗(yàn)

通過紙片擴(kuò)散法測試了菌株AH-16對22種藥物的敏感性，具體結(jié)果詳見表2。結(jié)果顯示，AH-16對頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星和萘啶酸等11種藥物敏感；中度敏感的抗菌藥物有紅霉素、妥布霉素、多黏菌素B；而對青霉素G、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、羅紅霉素、磺胺異惡唑、利福平等8種抗生素產(chǎn)生耐藥。

表2 AH-16對不同抗生素的敏感性Table 2 Sensitivity of Pathogen AH-16 to different Antibiotics

3 討論

3.1 嗜水氣單胞菌的致病性

近年來隨著我國養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖品種不斷增加，水產(chǎn)動(dòng)物疾病也頻繁發(fā)生，其中最為常見的是由氣單胞菌屬細(xì)菌感染引起的細(xì)菌性魚病。氣單胞菌屬細(xì)菌是自然環(huán)境中的常在菌，養(yǎng)殖水體、污水、土壤和水生動(dòng)物體表都能人為分離檢測到嗜水氣單胞菌，在特定條件下，可使水產(chǎn)動(dòng)物致病，當(dāng)魚體抵抗力下降、體表損傷或環(huán)境條件惡劣等條件下可導(dǎo)致其發(fā)病。研究顯示，魚類、牛蛙、龜鱉等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物如果被嗜水氣單胞菌感染后都能患病，若伴隨養(yǎng)殖環(huán)境惡化，則可出現(xiàn)爆發(fā)性死亡[16]。在本研究中，利用從患病草魚體內(nèi)分離出的嗜水氣單胞菌AH-16對健康鯽魚人工感染，結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌可以在較短時(shí)間內(nèi)使鯽魚出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，且出現(xiàn)死亡的魚體表現(xiàn)出肝脾糜爛，出血，腸道出血發(fā)紅等與自然發(fā)病草魚的癥狀一致，可以確定AH-16菌株是導(dǎo)致草魚患病的病原菌。攻毒結(jié)果顯示，嗜水氣單胞菌對鯽魚的LD50值為1.2×107cfu/mL，參照濮俊毅等[17]研究中對細(xì)菌毒力的判定標(biāo)準(zhǔn)，LD50在106-107cfu/mL內(nèi)的菌株則具有較強(qiáng)的毒力，顯示本研究中患病草魚分離菌AH-16具有較強(qiáng)的致病力。細(xì)菌的致病性取決于溶血素、S層蛋白及胞外蛋白酶[15]等毒力因子，嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的毒素可引起生物體廣泛而復(fù)雜的病理變化，以體表和內(nèi)臟器官的急性出血癥狀為多，從AH-16菌株的人工感染中可見，嗜水氣單胞菌對健康鯽魚有較強(qiáng)的致病性。

3.2 嗜水氣單胞菌病的科學(xué)防治

嗜水氣單胞菌病對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重，養(yǎng)殖者深受該疾病困擾。由于抗菌藥物的使用具有操作簡單、成本較低、效果較好的特點(diǎn)，在相當(dāng)長的時(shí)期內(nèi)抗菌藥物的使用仍是水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病防治的常用方法，但是由于養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中對抗菌藥物的不合理使用，致使耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，進(jìn)而影響到疾病治療效果。本實(shí)驗(yàn)采用22種抗菌藥物對病原菌AH-16進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示：AH-16對頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星和萘啶酸等11種藥物敏感（其中氯霉素為國家禁用藥物，因此氯霉素僅用于本次藥物敏感試驗(yàn)），而對8種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥，顯示出嗜水氣單胞菌AH-16為一種多重耐藥性菌株，對多種抗菌藥物產(chǎn)生抗性。因此在實(shí)際生產(chǎn)中可在對分離菌株有抑制作用的藥物中選擇一種或者幾種符合國標(biāo)的藥物對養(yǎng)殖魚體進(jìn)行治療。

嗜水氣單胞菌的來源不同，對抗生素的敏感程度也有差異，徐先棟等[18]的研究顯示嗜水氣單胞菌對新霉素、四環(huán)素、氯霉素敏感；陳言峰等[19]研究的研究結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌對慶大霉素、強(qiáng)力霉素敏感，而對利福平耐藥；而梁利國等[20]的報(bào)道顯示嗜水氣單胞菌對鏈霉素和復(fù)方新諾明表現(xiàn)出高度的敏感，對阿莫西林表現(xiàn)耐藥。楊寧等[21]的實(shí)驗(yàn)顯示嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、復(fù)方新諾明耐藥，對妥布霉素敏感。綜合不同研究者結(jié)果的差別可知，養(yǎng)殖地條件、養(yǎng)殖種類和用藥方法的差異導(dǎo)致病原菌所處的環(huán)境有所不同，從而在藥敏試驗(yàn)檢測中出現(xiàn)不同的結(jié)果。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的提高和養(yǎng)殖密度增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖中疾病頻發(fā)，對于一些細(xì)菌性疾病，養(yǎng)殖者通常使用抗菌藥物進(jìn)行控制，但由于長期使用單一種類的抗菌藥物，致使病原菌對某些抗生素產(chǎn)生耐藥性，且造成養(yǎng)殖環(huán)境的污染，因而養(yǎng)殖過程中暴發(fā)的疾病越來越難以防治。因此，養(yǎng)殖中對細(xì)菌性疾病的防治既要考慮病原菌對藥物的敏感性，也要根據(jù)漁藥的相關(guān)規(guī)定合理用藥。在選擇和使用抗生素時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，為了提高抗生素的使用效果，減少細(xì)菌性病原對藥物產(chǎn)生耐藥性，更不應(yīng)該長期使用同一種抗生素，應(yīng)做到科學(xué)且精準(zhǔn)使用抗菌藥物。