李小飛,侯立軍,劉 敏

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長(zhǎng)江口潮灘沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性

李小飛1,侯立軍2,劉 敏3*

(1.福建師范大學(xué),濕潤(rùn)亞熱帶生態(tài)地理過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350007；2.華東師范大學(xué),河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241；3.華東師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,地理信息科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241)

以長(zhǎng)江口潮灘為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序技術(shù),研究了潮灘沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性及其影響因素.結(jié)果表明,沉積物中古菌群落OTUs數(shù)量為900~1417,Shannon指數(shù)為7.02~8.02,均表現(xiàn)出從低鹽度向高鹽度樣點(diǎn)降低的變化特征.各采樣點(diǎn)古菌群落特異性O(shè)TUs占各采樣點(diǎn)總OTUs的24.2%~57.3%,而共有的OTUs僅占1.2%,說(shuō)明各樣點(diǎn)沉積物中古菌群落特異性較高.沉積物中古菌主要隸屬于廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)和奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota),而深古菌門(mén)(Bathyarchaeota)也是古菌群落的重要組成部分,其相對(duì)豐度占到17.7%~25.9%.主成分和聚類分析表明蘆潮港和東海農(nóng)場(chǎng)沉積物中古菌群落結(jié)構(gòu)相似,白龍港和瀏河口群落組成相近,而滸浦與其他采樣點(diǎn)的古菌群落組成差別較大.通過(guò)典范對(duì)應(yīng)分析,研究區(qū)沉積物中古菌群落結(jié)構(gòu)與沉積物鹽度水平有著非常密切的關(guān)系.上述研究結(jié)果表明長(zhǎng)江口潮灘沉積物中古菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性具有高度的空間差異性,且沉積物鹽度是群落差異的決定性影響因素.

高通量測(cè)序；古菌群落；多樣性；潮灘沉積物

河口潮灘是重要的生態(tài)系統(tǒng),其生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程受到人們的廣泛重視[1-2].生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程主要以微生物介導(dǎo)作用完成,微生物在物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)方面起著非常的重要作用[3].微生物種類豐富,數(shù)量龐大,適應(yīng)性強(qiáng),并且能夠?qū)Νh(huán)境變化做出快速而又敏感的反應(yīng),因而微生物成為了評(píng)價(jià)河口環(huán)境狀況和功能變化的重要指標(biāo)之一[4].近年來(lái),大量的人為污染物進(jìn)入到河口環(huán)境,對(duì)河口生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅[5].此外,由全球變化導(dǎo)致的海平面上升、鹽水入侵和植被入侵等環(huán)境問(wèn)題也影響著河口生態(tài)服務(wù)功能和生物地球化學(xué)循環(huán)[1-2,6-7].在這些環(huán)境變化下,河口潮灘微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性也勢(shì)必發(fā)生明顯的變化,進(jìn)而影響其生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程.因此,深入研究河口潮灘微生物群落的動(dòng)態(tài)變化及其影響因素具有重要的意義.

近年來(lái),河口環(huán)境微生物多樣性及其功能成為了熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容[4-5,8-9].有研究發(fā)現(xiàn)Chesapeake河灣爆發(fā)的季節(jié)性藍(lán)藻會(huì)對(duì)細(xì)菌群落產(chǎn)生重要的影響,這種影響主要通過(guò)細(xì)菌厭氧呼吸所導(dǎo)致[10].然而,也有研究發(fā)現(xiàn),浮游植物不是影響細(xì)菌群落的因素,而是受制于營(yíng)養(yǎng)鹽水平作用影響[4].此外,濱海地區(qū)由陸向海的空間距離是沉積物中微生物群落變化的最主要因素,并且微生物和是氮污染變化的敏感微生物群落[8].此外,有研究表明長(zhǎng)江口崇明東灘,中潮灘和低潮灘沉積物優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌(),高潮灘的優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌();并且細(xì)菌多樣性表現(xiàn)為中潮灘最高,而高低潮灘較低,由此說(shuō)明潮灘環(huán)境能夠顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[11].迄今為止,有關(guān)河口潮灘及近海沉積物中微生物的研究主要集中于細(xì)菌或氮循環(huán)微生物群落及影響因素,而古菌的群落結(jié)構(gòu)與多樣性及其對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)研究鮮見(jiàn)報(bào)道.在微生物群落中,古菌是一類有別于細(xì)菌的原核微生物[12-13],具有分布廣泛、資源潛力大,在生物地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用[14].此外,古菌具有獨(dú)特的基因類型和代謝特征,對(duì)環(huán)境變化具有適應(yīng)甚至改變能力[13,15-16].因此,研究河口潮灘古菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性對(duì)于了解河口生態(tài)服務(wù)功能具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和科學(xué)價(jià)值.

近年來(lái),受人類活動(dòng)高強(qiáng)度的影響,長(zhǎng)江口地區(qū)生態(tài)環(huán)境發(fā)生了顯著變化[17],不僅影響生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程,而且對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)與多樣性產(chǎn)生重要的影響[5,9].此外,由于咸淡水的交互作用以及人為污染物排放,長(zhǎng)江口環(huán)境因子具有明顯的時(shí)空差異特征[5].為此,本研究以長(zhǎng)江口潮灘為典型研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序技術(shù),開(kāi)展沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性及其影響因素研究,不僅可深化河口潮灘微生物對(duì)環(huán)境變化的認(rèn)識(shí),同時(shí)也可為評(píng)價(jià)河口生態(tài)環(huán)境提供重要的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與樣品采集

長(zhǎng)江口是長(zhǎng)江的入?？?位于我國(guó)東部濱海岸(21o5~122o30′E,30o52~31o46′N).因河流攜帶的泥沙和潮周期作用的影響,長(zhǎng)江口發(fā)育著廣闊的潮灘濕地[18].長(zhǎng)江口氣候類型為亞熱帶季風(fēng)氣候,夏季年平均溫度為28.9℃,冬季年平均溫度為5.6℃,且年平均降水量為1100mm[19].近年來(lái),由于人類活動(dòng)的影響,長(zhǎng)江口活性氮的濃度升高了約10倍,成為了富營(yíng)養(yǎng)化發(fā)生和加劇的主要因素之一[20].于2017年6月,在長(zhǎng)江口的滸浦(XP)、瀏河口(LHK)、白龍港(BLG)、東海農(nóng)場(chǎng)(DHNC)和蘆潮港(LCG)的5個(gè)潮灘落潮后露出的表層沉積物(0~5cm)進(jìn)行采集,采樣點(diǎn)空間分布如圖1.在樣品采集的過(guò)程中,現(xiàn)場(chǎng)記錄采樣點(diǎn)的經(jīng)緯度和潮灘環(huán)境整體特征.在每個(gè)樣點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)沉積物采集,相同質(zhì)量的鮮重沉積物混合,并保存于已滅菌的離心管中,放置于帶有冰塊的保溫箱中立即帶回實(shí)驗(yàn)室.在實(shí)驗(yàn)室里,將沉積物樣品充分混勻,并分成2份.一份沉積物保存于4℃冰箱中,立即分析其理化性質(zhì);另一份保存于–80℃超低溫冰箱中用于微生物分析.

圖1 長(zhǎng)江口采樣點(diǎn)地理位置

1.2 樣品理化性質(zhì)分析

沉積物pH值和鹽度用1:2.5(沉積物:水)混勻后,分別采用pH計(jì)(S210,梅特勒-托利多,瑞士)和鹽度計(jì)(YSI Model 30,美國(guó))測(cè)定.沉積物粒徑組成采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定(Mastersizer 2000,英國(guó)).經(jīng)過(guò)烘干研磨的沉積物用1mol/L鹽酸除去無(wú)機(jī)碳后,有機(jī)碳采用元素分析儀測(cè)定(MaxCNOHS,德國(guó)).沉積物中NH4+-N,NO3–-N和NO2–-N用2mol/L氯化鉀溶液浸提后,采用連續(xù)流動(dòng)儀測(cè)定(SAN+++, Skalar,荷蘭).沉積物二價(jià)鐵和三價(jià)鐵用1mol/L鹽酸浸提,采用鄰菲羅啉比色法測(cè)定[21].在樣品分析過(guò)程中,每個(gè)理化性質(zhì)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)測(cè)定,結(jié)果取平均值.

1.3 沉積物DNA提取與PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

沉積物DNA采用強(qiáng)力土壤DNA試劑盒,并按照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行提取(MoBio, USA).采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取后的DNA的濃度和純度(Thermo, USA),隨后用1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳.沉積物古菌群落以古菌16S rRNA的V4~V5區(qū)域作為目標(biāo)DNA序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[22].PCR 擴(kuò)增采用的引物為上游524F (5'–TGYCAGCCGCCGCGGTAA–3')和下游958R (5'–YCCGGCGTTGAVTCCAATT–3'),并各自添加不同的Barcode序列進(jìn)行V4~V5區(qū)域擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增均采用Takara試劑公司提供的試劑進(jìn)行,且反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,45個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min.PCR擴(kuò)增結(jié)束后,產(chǎn)物使用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳,將其進(jìn)行純化,并將純化后的產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技有限公司Illumina-Hiseq平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序(2′300bp).

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將測(cè)定的擴(kuò)增子采用QIIME軟件進(jìn)行分析.對(duì)原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,去除低質(zhì)量以及嵌合體序列,以獲得高精確和高質(zhì)量的DNA序列信息.采用鄰近算法,以97%的相似水平進(jìn)行古菌操作分類單元(OTU)進(jìn)行分類.采用MOTHUR計(jì)算每個(gè)樣本古菌的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao 1指數(shù)以及ACE指數(shù).群落結(jié)構(gòu)空間差異采用主成分和聚類方法分析.此外,采用典范對(duì)應(yīng)分析進(jìn)行沉積物理化因子與群落的相關(guān)性(Canoco, 4.5).

2 結(jié)果

2.1 沉積物理化性質(zhì)

從表1中可看出,沉積物鹽度在空間分布上具有明顯的差異,其值為0.2‰~5.5‰,最小值為滸浦,最大值為蘆潮港.沉積物pH值在空間差異變化較小,其值為7.6~8.2.白龍港沉積物TOC的含量最高(1.82%),而瀏河口沉積物TOC含量最低(1.31%).從沉積物中各形態(tài)無(wú)機(jī)氮的含量來(lái)看,NH4+-N含量最高,其值為34.8~73.2μg/g; NO3–含量為11.4~18.3μg/g,其中蘆潮港含量最低,瀏河口含量最高.各采樣點(diǎn)沉積物的NO2–-N含量差別較小,其值為0.05~0.08μg/g.沉積物中Fe(II)和Fe(III)含量分別是9.1~17.1mg/g和4.5~11.4mg/g.沉積物粒徑組成主要以粉粒為主,占58.7%~71.3%;其次是黏粒和砂粒,分別占13.2%~ 24.3%和4.4%~28.1%.

2.2 沉積物古菌群落豐富度和多樣性

經(jīng)古菌16S rRNA高通量測(cè)序,并將原始序列去除低質(zhì)量與嵌合體序列后,得到各潮灘沉積物古菌有效序列數(shù)量分別為58959,33918,44319,78839和36208.對(duì)這些有效序列進(jìn)行分析,分別得到1417,1082,1320,1087和900個(gè)古菌OTUs(表2).樣品測(cè)序文庫(kù)覆蓋率為97.2%~98.7%,說(shuō)明文庫(kù)達(dá)到飽和,所獲得的OTUs能夠代表樣品的所有古菌總量.古菌OTUs數(shù)量和Chao 1指數(shù)從低鹽度向高鹽度逐漸降低,即說(shuō)明低鹽度沉積物具有較高的古菌豐富度,而高鹽度沉積物具有較低的古菌豐富度.白龍港沉積物古菌OTUs數(shù)量最高,而滸浦沉積物中古菌Chao 1指數(shù)最高;蘆潮港沉積物OTUs數(shù)量和Chao 1指數(shù)最低.

表1 潮灘沉積物理化性質(zhì)

注:不同小寫(xiě)字母表示樣點(diǎn)之間的顯著性差異(<0.05).

此外,ACE指數(shù)也代表古菌物種數(shù)量,其值為1012~1866,表現(xiàn)出低鹽度沉積物高,高鹽度沉積物低.

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示群落多樣性.發(fā)現(xiàn)滸浦樣點(diǎn)古菌的Shannon指數(shù)最高,白龍港樣點(diǎn)古菌的Simpson指數(shù)最高.從古菌豐富度和多樣性來(lái)看,兩者都表現(xiàn)出隨鹽度升高而降低,特別是鹽度最高的蘆潮港的古菌豐富度和多樣性最低,由此說(shuō)明鹽度對(duì)古菌群落的豐富度和多樣性產(chǎn)生重要影響.

表2 潮灘沉積物古菌群落高通量測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量匯總

注:XP為滸浦,LHK為瀏河口,BLG為白龍港,DHNC為東海農(nóng)場(chǎng),LCG為蘆潮港,下同.

圖2 采樣點(diǎn)潮灘沉積物古菌群落高通量測(cè)序OTUs維恩圖

采用維恩圖分析了古菌群落OTUs在不同采樣點(diǎn)之間的相似性和特異性特征,結(jié)果見(jiàn)圖2.從圖中可看出,5個(gè)采樣點(diǎn)潮灘沉積物中共有的古菌OTUs數(shù)量為72,僅占到總OTUs數(shù)量的1.2%,且主要屬于廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)和奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota).研究區(qū)滸浦、瀏河口、白龍港、東海農(nóng)場(chǎng)和蘆潮港樣點(diǎn)沉積物中特有的古菌OTUs數(shù)量分別為795,262,376,577和516,其中滸浦樣點(diǎn)沉積物古菌特有的OTUs最多,是瀏河口樣點(diǎn)沉積物古菌特異性O(shè)TUs最小的3倍.各樣點(diǎn)沉積物特有的古菌群落OTUs占到各總OTUs的24.2%~57.3%,其中蘆潮港所在比例最高,而瀏河口最低.通過(guò)對(duì)古菌群落結(jié)構(gòu)PCoA分析,表明古菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較大的差異.主成分1和2分別貢獻(xiàn)了48.2%和29.9%,其中白龍港和瀏河口相似性距離較近,與蘆潮港、東海農(nóng)場(chǎng)和滸浦分離較遠(yuǎn).潮灘沉積物古菌群落空間差異與沉積物鹽度分布極為相似,由此說(shuō)明鹽度是古菌群落差異的主要因素.

圖3 采樣點(diǎn)潮灘沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)PCoA分析

2.3 沉積物古菌群落組成特征

采樣點(diǎn)沉積物古菌群落在門(mén)水平的相對(duì)豐度如圖4所示.沉積物古菌主要隸屬于廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)、奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)和深古菌門(mén)(Bathyarchaeota).廣古菌門(mén)在樣點(diǎn)蘆潮港、白龍港和瀏河口樣點(diǎn)沉積物占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),相對(duì)豐度占47.0%、50.9%和52.9%.東海農(nóng)場(chǎng)和滸浦樣點(diǎn)沉積物中奇古菌門(mén)占主要優(yōu)勢(shì),相對(duì)豐度為47.3%和37.8%.此外,沉積物中深古菌門(mén)也占到很大一部分,特別是瀏河口、白龍港和蘆潮港樣點(diǎn)的深古菌門(mén)相對(duì)豐度達(dá)到25.23%、24.85%和25.91%.

圖4 采樣點(diǎn)潮灘沉積物古菌在門(mén)分類水平的相對(duì)豐度

根據(jù)群落相對(duì)豐度以及古菌群落top10進(jìn)行主要優(yōu)勢(shì)群落分析[13].各采樣點(diǎn)沉積物中古菌群落結(jié)構(gòu)組成和主要優(yōu)勢(shì)菌屬(Top 10)所占比例差異較大(圖5).蘆潮港沉積物中占優(yōu)勢(shì)的古菌菌屬為(甲烷八疊球菌屬)、(擬甲烷球菌屬)以及(氨氧化古菌),相對(duì)豐度分別占到21.3%、5.3%和2.9%.東海農(nóng)場(chǎng)沉積物中占優(yōu)勢(shì)的古菌菌屬分別為(氨氧化古菌屬,17.1%)、(甲烷粒菌屬, 4.8%)和(甲烷八疊球菌屬,1.1%).白龍港沉積物中占優(yōu)勢(shì)的古菌菌屬分別為(甲烷鬃菌屬,16.1%)、(甲烷桿菌屬,9.2%)、(甲烷微菌屬,5.2%)、(甲烷繩菌屬,4.2%).瀏河口沉積物中古菌菌屬主要為(甲烷鬃菌屬,18.7%)、(甲烷微菌屬,6.2%)、(甲烷桿菌屬,5.6%)和(甲烷繩菌屬,5.5%).滸浦沉積物中占優(yōu)勢(shì)的古菌菌屬為(甲烷鬃菌屬,5.7%)、(甲烷桿菌屬,5.7%)、uncultured_(泉古菌屬,2.9%)和_(甲烷氧化古菌屬,2.1%).

采用Unifrac法將沉積物古菌菌屬進(jìn)行加權(quán)聚類分析,并考慮古菌菌屬的數(shù)量特征和進(jìn)化關(guān)系,以此計(jì)算出樣品之間的聚類關(guān)系與熱圖(圖6).從圖中可看出,蘆潮港和東海農(nóng)場(chǎng)的古菌群落組成相似性較近,白龍港和瀏河口古菌物種組成相近,而滸浦與其他采樣點(diǎn)的古菌物種組成差異較大,由此說(shuō)明沉積物環(huán)境影響著古菌群落的空間差異.各樣點(diǎn)沉積物中古菌菌屬存在較大的差異,均有特異性的古菌群落.白龍港沉積物主要分布的古菌菌屬為和6個(gè)屬群落.等8個(gè)古菌菌屬主要分布于瀏河口.而滸浦沉積物優(yōu)勢(shì)古菌菌屬與其他采樣點(diǎn)沉積物中的古菌菌屬完全不同,主要是11個(gè)菌屬.和ANME-3等6個(gè)古菌菌屬主要分布于蘆潮港.7個(gè)古菌屬分布于東海農(nóng)場(chǎng).

圖5 采樣點(diǎn)潮灘沉積物古菌的Top 10菌屬相對(duì)豐度

圖6 采樣點(diǎn)潮灘沉積物古菌屬相水平聚類分布

2.4 古菌群落組成與理化因子關(guān)系

圖7 潮灘沉積物中古菌Top10菌屬群落組成與環(huán)境因子的典型相關(guān)分析

數(shù)字1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表古菌群落菌屬、、、、、、、、、

通過(guò)典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)了古菌群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系.CCA1 和CCA2 的特征值分別是54.5%和41.4%(圖7),共解釋了總變異的95.6%,說(shuō)明這些環(huán)境因子能夠很好地解釋沉積物中古菌群落結(jié)構(gòu)的變化.從圖7可知,古菌優(yōu)勢(shì)菌屬u(mài)ncultured和與鹽度具有明顯的相關(guān)性,說(shuō)明鹽度對(duì)這幾種優(yōu)勢(shì)菌屬具有顯著的影響.沉積物中Fe(II)是影響產(chǎn)甲烷菌屬和的因素.此外,NO3–-N與NO2–-N對(duì)古菌菌屬和也有一定的影響.因此,從以上分析的結(jié)果看,長(zhǎng)江口潮灘沉積物中古菌群落的分布與鹽度具有非常密切的關(guān)系,表明鹽度是古菌群落差異的決定性因素.

3 討論

自然環(huán)境中微生物群落組成與分布是多種環(huán)境因子綜合作用的結(jié)果,既具有普遍性,也具有特異性[23].微生物對(duì)外部環(huán)境變化具有很強(qiáng)的敏感性,因此,微生物的群落組成與動(dòng)態(tài)變化在很大程度上能夠指示環(huán)境因子的變化.古菌是一類分布廣泛的微生物群落,具有環(huán)境來(lái)源特異和功能作用突出的特征,且參與碳氮生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程[24-25].不同的自然環(huán)境中,其水熱組合與環(huán)境因子存在很大的差異,從而顯著地影響古菌群落的組成和多樣性.有研究報(bào)道我國(guó)不同地區(qū)鹽堿土古細(xì)菌群落組成差異較大,主要以廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)和奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)為主,分別占總?cè)郝涞?.0%~67.8%和2.8%~72.7%,此外還有少量的泉古菌門(mén)(Crenarchaeota)[13].然而,有研究發(fā)現(xiàn)黃河口不同鹽生植被類型土壤古菌主要屬于泉古菌門(mén)(Crenarchaeota)和廣古菌門(mén)(Euryarchaeota),廣古菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群,相對(duì)豐度占4.63%(白茅土壤)~ 97.15%(光板地);泉古菌門(mén)的相對(duì)豐度比廣古菌門(mén)小得多,僅為0.05%(翅堿蓬土壤)~1.61%(白茅土壤)[26].本研究對(duì)長(zhǎng)江口潮灘沉積物中古菌群落分析,發(fā)現(xiàn)各采樣點(diǎn)沉積物中古菌群落組成結(jié)構(gòu)一致,不僅包括了分布廣泛的廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)和奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota),還有深古菌門(mén)(Bathyarchaeota)這類特異性較高的古菌群落,特別是瀏河口、白龍港和蘆潮港沉積物中的深古菌門(mén)占到很大一部分,相對(duì)豐度分別為25.23%、24.85%和25.91%.深古菌門(mén)(Bathyarchaeota)能夠降解芳香族化合物,具有生物降解的能力,在自然環(huán)境中參與污染物降解等生態(tài)活動(dòng)[27].本研究中瀏河口、白龍港和蘆潮港均為船舶港口,柴油泄漏和燃燒等烷烴有機(jī)污染嚴(yán)重,從而導(dǎo)致沉積物中具有較豐富的深古菌門(mén)群落.此外,潮灘沉積物中還發(fā)現(xiàn)豐度較高的一類古菌菌門(mén)Lokiarchaeota(洛基古菌),相對(duì)豐度0.2%~ 3.2%,該群落一般生活在深海熱泉,而陸地環(huán)境分布較少[14].因此,河口潮灘中的古菌群落比其他環(huán)境更具有豐富和特異的古菌群落組成,這可能是由于河口潮灘復(fù)雜的環(huán)境差異所導(dǎo)致的.然而,河口潮灘環(huán)境的物理、化學(xué)和生物因子時(shí)空變化劇烈,古菌群落組成、豐度和多樣性很可能具有很大的空間差異性.

長(zhǎng)江口潮灘沉積物中優(yōu)勢(shì)古菌菌屬主要為產(chǎn)甲烷古菌屬、氨氧化古菌屬以及甲烷氧化古菌.然而,采樣點(diǎn)沉積物中的古菌優(yōu)勢(shì)菌屬既具有相似性又存在著一定的差別,其中鹽度較高的蘆潮港和東海農(nóng)場(chǎng)存在相同的菌屬有(甲烷八疊球菌屬)、以及(氨氧化古菌屬);鹽度較低的白龍港和瀏河口相同的菌屬為(甲烷鬃菌屬)、(甲烷桿菌屬)、(甲烷微菌屬)和(甲烷繩菌屬);而鹽度最低的滸浦為(甲烷鬃菌屬)、(甲烷桿菌屬)、uncultured(泉古菌屬)和(甲烷氧化古菌屬).有研究表明閩江口潮汐淡水沼澤濕地土壤中優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌為(甲烷微菌屬)和(甲烷八疊球菌屬)[28].此外,渤海沉積物中產(chǎn)甲烷菌的優(yōu)勢(shì)菌屬為(甲烷桿菌屬)和(甲烷八疊球菌屬)[29].與前人研究結(jié)果相比,長(zhǎng)江口潮灘沉積物的產(chǎn)甲烷菌菌屬種類較多,有(甲烷八疊球菌屬)、(甲烷鬃菌屬)、(甲烷桿菌屬)、(甲烷微菌屬)和(甲烷繩菌屬).有研究揭示產(chǎn)甲烷菌較適宜在具有一定鹽性的環(huán)境中生長(zhǎng)[30],長(zhǎng)江口潮灘環(huán)境有著較廣的鹽度梯度差異,且環(huán)境因子組合多樣,這也可能導(dǎo)致不同類型的產(chǎn)甲烷菌群的分布.

本研究中,潮灘沉積物古菌菌屬分布較多的還有,屬于氨氧化古菌,其中鹽度較高的東海農(nóng)場(chǎng)和蘆潮港分布最多,相對(duì)豐度分別為17.1%和3.0%,其他采樣點(diǎn)的相對(duì)豐度均低于0.2%,說(shuō)明菌屬適宜在高鹽度環(huán)境生長(zhǎng).能夠把NH4+-N氧化成NO2–-N,利用NH4+-N作為唯一能源正常生長(zhǎng)[31].有研究表明在潮灘環(huán)境硝化速率與氨氧化古菌具有顯著的相關(guān)性,而與氨氧化細(xì)菌不相關(guān),氨氧化古菌對(duì)硝化過(guò)程的貢獻(xiàn)比氨氧化細(xì)菌更大,說(shuō)明氨氧化古菌對(duì)硝化作用起到主導(dǎo)作用[30].此外,在大多數(shù)陸地與水生態(tài)環(huán)境中,氨氧化古菌的豐度和表達(dá)量一般高于氨氧化細(xì)菌,表明氨氧化古菌在氮素循環(huán)中的生態(tài)功能更加重要[31].受人為活動(dòng)的影響,河口環(huán)境氮污染日益嚴(yán)重,氨氧化古菌在河口環(huán)境的生態(tài)作用更加明顯.近年來(lái),自然環(huán)境中菌群因其參與氮和甲烷耦合過(guò)程,且能夠氧化甲烷和去除硝酸鹽,該群落因而引起了人們的廣泛關(guān)注.本研究中,所有采樣點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)了菌群的存在,鹽度最低的滸浦沉積物中相對(duì)豐度最高(2.1%),而鹽度高的蘆潮港和東海農(nóng)場(chǎng)相對(duì)豐度最低(3.1~9.3),表明菌群不適宜在高鹽度環(huán)境.然而,由于PCR擴(kuò)增引物特異性的限制,沉積物中還可能會(huì)有一些尚未檢測(cè)到的古菌群落,需要采用多種方法與手段進(jìn)行分析,以此得到更加全面的群落信息.

有學(xué)者對(duì)淡水濕地研究發(fā)現(xiàn),隨著添加鹽度的增加,土壤中產(chǎn)甲烷菌群落多樣性降低[32].同樣,本研究發(fā)現(xiàn)河口潮灘沉積物古菌群落豐富度和多樣性隨著鹽度增加而降低(表2),表明鹽度能夠顯著地影響古菌群落.然而,也有研究報(bào)道渤海沉積物鹽度不是影響古菌群落結(jié)構(gòu)的因素,這可能是因?yàn)樵撗芯繀^(qū)的鹽度梯度變化較小[29].此外,從群落進(jìn)化親緣距離來(lái)看,鹽度對(duì)古菌群落進(jìn)化具有非常重要的影響.本研究發(fā)現(xiàn),相同的鹽度環(huán)境具有較相似的進(jìn)化關(guān)系(圖3、6),親緣關(guān)系較近,說(shuō)明具有高度相似的古菌群落結(jié)構(gòu)組成.因此,在河口潮灘環(huán)境中,鹽度是影響沉積物中古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的關(guān)鍵性因素.此外,也有研究表明沉積物中Fe(II)離子也是影響產(chǎn)甲烷菌屬和的因子,這是因?yàn)楦邼舛鹊腇e(II)能夠促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)[30].同樣,本研究也發(fā)現(xiàn)潮灘沉積物中Fe(II)對(duì)古菌群落和也有一定的影響.有研究證實(shí),在淹水環(huán)境下,氨氧化古菌豐度比細(xì)菌要高,這是因?yàn)樵诘脱趸蛉毖醐h(huán)境更有利于古菌微生物的生長(zhǎng);同時(shí)古菌也能夠在較低營(yíng)養(yǎng)鹽環(huán)境中得到生長(zhǎng)[33].此外,植被也會(huì)通過(guò)營(yíng)養(yǎng)鹽和電子供體有效性來(lái)對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生重要的影響,因而在今后的研究中也應(yīng)引起重視[37].本研究中各樣點(diǎn)之間存在較少的共有OTUs數(shù)量(圖2),進(jìn)一步說(shuō)明潮灘沉積物古菌群落的空間差異較大,且復(fù)雜多變的環(huán)境條件是影響沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)差異的重要因素.

4 結(jié)論

4.1 長(zhǎng)江口潮灘沉積物中古菌物種豐富度和多樣性空間變化明顯,表現(xiàn)出從低鹽度向高鹽度環(huán)境降低的特征.

4.2 潮灘沉積物中古菌以廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)、奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)和深古菌門(mén)(Bathyarchaeota)為主;樣點(diǎn)蘆潮港、東海農(nóng)場(chǎng)、白龍港、瀏河口和滸浦沉積物中的最優(yōu)勢(shì)古菌菌屬分別為(21.3%),(17.1%),(16.1%),(18.7%)和(5.7%).

4.3 特有古菌群落占到各采樣點(diǎn)總古菌群落的24.2%~57.3%,且特異性程度隨采樣點(diǎn)沉積物鹽度升高而增加.

4.4 鹽度是潮灘沉積物中古菌豐富度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)空間差異的主要決定性因子.

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Archaeal community structure and diversity in intertidal sediments of the Yangtze River Estuary.

LI Xiao-fei1, HOU Li-jun2, LIU Min3*

(1.Key Laboratory for Humid Subtropical Eco-geographical Processes of the Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China；2.State Key Laboratory of Estuarine and Costal Research, East China Normal University, Shanghai 200241, China；3.Key Laboratory of Geographic Information Science of the Ministry of Education, School of Geographic Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China)., 2019,39(4)：1744~1752

High-throughput sequencing was used to investigate the archaeal community structure and diversity, and associated influencing factors in the intertidal sediments of the Yangtze Estuary. The results indicated that the OTUs and Shannon index of archaeal community in the intertidal sediments were 900~1417 and 7.02~8.02, respectively, which both decreased from low to high salinity sampling sites. The specific OTUs of archaeal community structure accounted for 24.2%~57.3% of total OTUs in each sampling site, and identical OTUs only occupied for 1.2%, indicating that archaeal community structure varied highly along the sampling sites. The archaeal community was dominated by the Euryarchaeota and Thaumarchaeota. The Bathyarchaeota contributed a great parts of archaeal community, accounting for 17.7%~25.9% of total community. The principal component and cluster analysis suggested that the archaeal community structure in sites LCG and DHNC was similar, and archaeal community structure in BLG showed a similarity with LHK, while archaeal community structure showed a great difference in XP compared to others sampling sites. Canonical correlation analysis suggested that distribution of archaeal community structure in the intertidal sediments was tightly correlated with the sediment salinity. These results indicated that archaeal community structure and diversity were highly variable in the intertidal sediments of the Yangtze Estuary. In addition, sediment salinity was the crucial factor affecting the variabilities in archaeal community structure and diversity in the Yangtze Estuary.

high-throughput sequencing；archaeal community；diversity；intertidal sediment

X172

A

1000-6923(2019)04-1744-09

2018-09-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41701548,41761144062)

*責(zé)任作者, 教授, mliu@geo.ecnu.edu.cn

李小飛(1987-),男,四川達(dá)州人,博士,講師,主要從事氮循環(huán)及其微生物作用機(jī)理方面研究.發(fā)表論文10余篇.