王 璇 賈洪誠(chéng) 孫 正

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamouscell carcinoma，OSCC)占口腔癌90%以上，發(fā)病率和死亡率較高，全世界每年新發(fā)病例超過(guò)27.5萬(wàn)，我國(guó)OSCC發(fā)病率也同樣很高，每年新發(fā)病例11900例，約5000人死于OSCC[1-4]。OSCC是一個(gè)多基因、多因子互相作用的復(fù)雜過(guò)程，目前還缺少有效的、微創(chuàng)的監(jiān)測(cè)手段。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子，起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”[5]。然而，近年來(lái)的研究表明，lncRNAs參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程，可以在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)[6]。轉(zhuǎn)錄譜分析顯示lncRNAs在人類(lèi)腫瘤中的表達(dá)明顯異常，和腫瘤的分子病理機(jī)制有關(guān)，lncRNA具有腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)因子功能，有望成為腫瘤的潛在標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。然而，OSCC患者血漿中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用lncRNA芯片技術(shù)，比較OSCC患者和健康者血漿中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)情況，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析靶基因的生物學(xué)效應(yīng)，以探討OSCC相關(guān)lncRNAs與OSCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以期為OSCC的早期診斷和預(yù)后判斷提供理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 研究樣本 于2013年12月至2015年5月間在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院黏膜科和口腔外科收集入組，簽署知情同意書(shū)，一般狀況見(jiàn)表1。所有受試者均未行放化療，無(wú)其他系統(tǒng)性病史，各重要器官功能無(wú)異常。本研究項(xiàng)目經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。于清晨空腹采集血漿，用紫帽采血管(EDTA抗凝)采取靜脈血10ml，4℃、1000×g離心10min，分離血漿和細(xì)胞組分，將采集好的血漿轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的EP凍存管，按照每400～500ul/管分裝好，于-80℃凍存、待檢。

表1 研究人群的一般狀況

1.2 芯片雜交實(shí)驗(yàn) 研究所用芯片為Arraystar人類(lèi)lncRNA芯片(v4.0)，由上?？党缮锛夹g(shù)有限公司協(xié)助完成。按照Arraystar LncRNA Array Protocol標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行芯片雜交實(shí)驗(yàn)。完成雜交的芯片采用Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)進(jìn)行掃描，使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)獲得芯片圖，并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和隨后的數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過(guò)篩選高質(zhì)量探針(某探針在6個(gè)樣品中至少有3個(gè)被標(biāo)記為Present或Marginal)進(jìn)行進(jìn)一步分析。差異表達(dá)lncRNAs或DEGs通過(guò)P-value/FDR篩選，P值利用t-test計(jì)算，并根據(jù)Benjamini Hochberg FDR方法進(jìn)行修正(即FDR值)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|Fold change|≥2.0且FDR＜0.05。DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析，使用編寫(xiě)腳本進(jìn)行層次聚類(lèi)和關(guān)聯(lián)分析。

1.4 Real-time PCR驗(yàn)證 根據(jù)芯片結(jié)果，選取14條lncRNAs做芯片同源血漿樣本PCR驗(yàn)證。Realtime PCR反應(yīng)體系為：5μl 2×Master Mix、0.5μl 10uM的 PCR特異引物F、0.5μl 10uM 的PCR特異引物R、加水至總體積為8μl；將8ul混合液加到384-PCR板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，再加入對(duì)應(yīng)的2μl cDNA。PCR儀為ViiA 7 Real-time PCR System(Applied Biosystems)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10min；共40個(gè)PCR 循環(huán)(95℃10s，60℃60s，熒光檢測(cè)1次)。引物設(shè)計(jì)軟件為Primer 5.0。使用管家基因β-actin作為內(nèi)參。組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2.結(jié)果

2.1 血漿總RNA放大和標(biāo)記情況 血漿總RNA放大和標(biāo)記結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 血漿總RNA的熒光標(biāo)記放大結(jié)果

2.2 芯片雜交圖像 芯片信號(hào)清晰，無(wú)邊緣化效應(yīng)，證明芯片結(jié)果可用。具體見(jiàn)圖1～圖6。

圖1 (H5)

圖2 (X474)

圖3 (H8)

圖4 (X574)

圖5 (H13)

圖6 (X602)

2.3 箱體圖分析 由圖7、圖8可以觀察到芯片掃描后各個(gè)樣本熒光密度值標(biāo)準(zhǔn)化之后的分布，其平均值基本保持在同一水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了芯片掃描讀數(shù)的穩(wěn)定件。

圖8 Box Plot-mRNA

圖7 Box Plot-lncRNA

2.4 差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs OSCC組和健康對(duì)照組相比，有6606個(gè)lncRNAs表達(dá)有差異，其中上調(diào)3511個(gè)，下調(diào)3095個(gè)；同時(shí)檢測(cè)到有4196個(gè)mRNAs表達(dá)有差異，其中上調(diào)1766個(gè)，下調(diào)2430個(gè)。

2.5 聚類(lèi)分析 聚類(lèi)圖橫軸代表樣本聚類(lèi)，縱軸代表基因聚類(lèi)，紅色代表高的相對(duì)表達(dá)量，綠色代表低的相對(duì)表達(dá)量(圖9，圖10)?？梢?jiàn)，這些差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs可以很好的將OSCC和健康組區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖10 差異表達(dá)mRNAs的聚類(lèi)分析

2.6 DEGs的GO分析 對(duì)差異lncRNAs的靶基因進(jìn)行Gene Ontology的生物學(xué)的分類(lèi)，可以獲得lncRNAs靶基因?qū)?yīng)的顯著性功能，從而了解lncRNAs的功能。表達(dá)上調(diào)的mMRAs共富集到266條BP術(shù)語(yǔ)、33條CC術(shù)語(yǔ)、57條MF術(shù)語(yǔ)；表達(dá)下調(diào)的mRNAs共富集到266條BP術(shù)語(yǔ)、90條CC術(shù)語(yǔ)、55條MF術(shù)語(yǔ)。差異表達(dá)mRNAs富集的GO術(shù)語(yǔ)差異顯著性(按照P值排序)前十者見(jiàn)表3、4。

表3 表達(dá)上調(diào)mRNAs富集的GO生物學(xué)術(shù)語(yǔ)(前10個(gè))

續(xù)表

2.7 DEGs的KEGG生物學(xué)通路分析 京都大學(xué)基因和基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG)，是系統(tǒng)分析基因功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)差異表達(dá)mRNAs數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG生物學(xué)通路分析(Pathway analysis)分析，上調(diào)的mRNAs在8條基因通路中富集程度比較高(表5)，下調(diào)的mRNAs在14條基因通路中富集程度比較高(表6)。

2.8 待測(cè)基因以?xún)?nèi)參校正后的相對(duì)表達(dá)量比較與對(duì)照組相比，OSCC組14個(gè)lncRNAs均呈差異表達(dá)，除了NR_024050下調(diào)(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)外，其余13個(gè)lncRNAs均上調(diào)，有9個(gè)lncRNAs的差異倍數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表7)。這與lncRNA芯片結(jié)果基本一致。

表4 表達(dá)下調(diào)mRNAs富集的GO生物學(xué)術(shù)語(yǔ)(前10個(gè))

續(xù)表

表5 表達(dá)上調(diào)mRNAs富集的生物學(xué)通路

表6 表達(dá)下調(diào)mRNAs富集的生物學(xué)通路

表7 14個(gè)lncRNAs相對(duì)表達(dá)量及差異表達(dá)倍數(shù)(OSCC/H)

續(xù)表

3.討論

雖然lncRNA芯片檢測(cè)信息量大，但篩選出來(lái)的lncRNA質(zhì)量并不很穩(wěn)定，缺乏可重復(fù)性，芯片上所有探針雜交條件的一致性限定了雜交的特異度，導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性率較高。血清/血漿中RNA含量低于分光光度計(jì)測(cè)量的下限，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量，因此無(wú)法通過(guò)測(cè)量OD值或比值來(lái)判斷純度或濃度，同時(shí)無(wú)細(xì)胞的血清/血漿中RNA主要是小RNA，傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性也不適于血清/血漿中RNA。為了避免芯片篩選出現(xiàn)假陽(yáng)性，驗(yàn)證芯片結(jié)果的可信度，作為芯片實(shí)驗(yàn)反向質(zhì)控步驟，本研究利用PCR方法對(duì)芯片同源血漿樣本做了驗(yàn)證。結(jié)果證明，血漿樣本質(zhì)量完好，lncRNA量充足?；虮磉_(dá)的差異方向與芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步確認(rèn)這些基因在OSCC血漿中差異表達(dá)，同時(shí)也說(shuō)明芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

大量研究證明lncRNA表達(dá)失調(diào)可以作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。比如MALAT1可作為前列腺癌早期診斷的標(biāo)志物[7]，HOTAIR表達(dá)上調(diào)提示結(jié)腸癌和乳腺癌預(yù)后差[8]，GAS5表達(dá)下調(diào)提示胃癌預(yù)后差[9]，HULC在肝癌中表達(dá)異常[10]等。本研究發(fā)現(xiàn)，OSCC血漿中有6606個(gè)lncRNAs和4196個(gè)mRNAs表達(dá)有顯著性差異。聚類(lèi)分析表明，這些DEGs對(duì)樣本有很好的聚類(lèi)作用。

GO分析顯示，有532個(gè)DEGs在生物學(xué)進(jìn)程方面富集程度較高，123個(gè)DEGs在細(xì)胞組件方面富集度較高，112個(gè)DEGs在分子功能方面富集度較高。這些功能涉及到腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等整個(gè)細(xì)胞周期過(guò)程，由此可見(jiàn)機(jī)體調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，這些DEGs可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的各個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和惡變過(guò)程，而這些DEGs以及它們參與調(diào)控的路徑均有可能成為OSCC分子診斷和基因干預(yù)治療的新靶點(diǎn)。

我們進(jìn)一步對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG Pathway分析，獲得了DEGs所參與的細(xì)胞生命活動(dòng)調(diào)節(jié)通路。上調(diào)mRNAs參與了8條通路，下調(diào)mRNAs參與了14條通路。這些通路大部分都包含有炎癥、免疫、代謝等相關(guān)因子和路徑。比如，RIG-I樣受體信號(hào)通路中包含了泛素介導(dǎo)的蛋白水解、MAPK信號(hào)通路等。HIF-1信號(hào)通路包含mTOR、MAPK、VEGF和PI3K-Akt信號(hào)通路，亨廷頓病通路中包含p53信號(hào)通路。諸多證據(jù)表明PI3KAkt信號(hào)通路在腫瘤的進(jìn)展中起著重要的作用[11-13]，這條通路在原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性腫瘤中表達(dá)均明顯增高[12，14]。維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體(Retinoic acidinduciblegene I，RIG-I)是機(jī)體識(shí)別病毒的主要模式識(shí)別受體之一，RIG-I基因可能具有腫瘤抑制劑作用[15]，RIG-I信號(hào)通路異?？蓪?dǎo)致炎癥、免疫疾病和腫瘤發(fā)生，RIG-I可以通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 9，MMP9)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[16]，RIG-I也可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt激活，對(duì)鱗癌細(xì)胞產(chǎn)生雙重作用：低劑量的病毒雙鏈RNA活化RIG-I，促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)，而高劑量的病毒活化RIG-I導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這些發(fā)現(xiàn)提示雙鏈RNA介導(dǎo)的RIG-I激活在頭頸部鱗癌的發(fā)生發(fā)展中具有潛在的關(guān)鍵作用[17]。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、生存、凋亡等，與腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)[18]。

總之，OSCC患者血漿lncRNA表達(dá)譜發(fā)生了顯著變化，DEGs功能涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等整個(gè)細(xì)胞周期過(guò)程，涉及到的通路包括：信號(hào)傳導(dǎo)通路、炎癥相關(guān)通路、代謝相關(guān)通路、細(xì)胞周期等。眾多基因及通路組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和惡變過(guò)程。LncRNA是當(dāng)代表觀遺傳學(xué)中最有潛力的基因表達(dá)調(diào)控模式[19]，對(duì)lncRNA表達(dá)譜的研究及相關(guān)生物信息學(xué)分析有助于OSCC治療靶點(diǎn)的鑒定和生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。在后續(xù)研究中需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，深入研究證實(shí)結(jié)論的可靠性并篩選出在OSCC中具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值的lncRNAs。