王 幸，許妍妍，楊珅珅，王玉明，李遇伯

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617）

近年來，中藥的安全和療效日益受到國際的廣泛關(guān)注。然而由于中藥化學(xué)成分和人體的復(fù)雜性，導(dǎo)致其功效機制研究面臨困境[1]，有關(guān)“中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)科學(xué)內(nèi)涵的內(nèi)在關(guān)聯(lián)機制”的報道較少。這主要是由于中藥功效存在兩個關(guān)鍵問題：一是功效評價缺少進程效應(yīng)指標(biāo)，無法明確中藥在體內(nèi)發(fā)揮功效的成分；二是功效產(chǎn)生的始動因素不清楚，其與最終功效效應(yīng)的相關(guān)性仍需進一步探討。因此，本研究借助經(jīng)濟合作與發(fā)展組織提出的有害結(jié)局路徑（A OP）概念框架[2]，提出功效結(jié)局路徑（PO P），從3個關(guān)鍵要素——功效分子起始事件（始動因素）、功效關(guān)鍵事件（功效進程拐點）以及功效結(jié)局出發(fā)，綜合借助各項新技術(shù)，建立中藥功效進程動態(tài)機制的新方法。采取“top-down”策略，從功效結(jié)局開始，逐級確定低層次功效關(guān)鍵事件并與特定功效分子起始事件相關(guān)聯(lián)。本研究將為祛風(fēng)濕類中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究提出一項新的適宜模塊化方法。

1 基于結(jié)局路徑的中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路

1.1 中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究近況 中藥是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下應(yīng)用的一類藥物，具有多成分、多靶點、系統(tǒng)調(diào)節(jié)的特點。目前，中藥的安全和療效日益受到國際的廣泛關(guān)注，而其所含化學(xué)成分種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功效與物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，使其在國際發(fā)展中受阻[3-7]。中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)決定著其安全性和有效性，而中藥的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥質(zhì)量控制的重要依據(jù)[7-8]。因此，明確中藥的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)對中藥的現(xiàn)代化和國際化發(fā)展意義重大[9-10]。目前，中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)的研究方法主要包括：體內(nèi)活性追蹤法、中藥譜效關(guān)聯(lián)研究法、體外細胞膜色譜法、中藥代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究技術(shù)，以及化學(xué)生物學(xué)技術(shù)、點擊化學(xué)技術(shù)與分子對接技術(shù)等[11-12]。

體內(nèi)活性追蹤法是基于中藥化學(xué)理論與方法，通過辨識有效部位群，從而追蹤與其結(jié)合的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的方法，姜雪萍[13]采用活性追蹤法研究水蘇乙醇提取物有效部位的抗氧化活性，并追蹤了水蘇抗氧化活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，但只是初步篩選了中藥的功效成分，忽略了其藥效與化學(xué)成分間的相互作用。中藥譜效關(guān)聯(lián)研究法是目前中藥質(zhì)量控制與物質(zhì)基礎(chǔ)研究中較為前沿的方法，可關(guān)聯(lián)中藥指紋圖譜中各種化學(xué)成分的變化和中藥的藥效，揭示中藥的主要功效成分，但其結(jié)果往往易受中藥指紋圖譜的穩(wěn)定性、數(shù)據(jù)分析方法等因素的影響，亦存在許多問題[14-15]。體外細胞膜色譜法是一種可以在體外實現(xiàn)藥物體內(nèi)過程的生物色譜技術(shù)，其作為一種新興技術(shù)，可將色譜分離與活性成分篩選相結(jié)合，適用于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，但其在闡明潛在活性成分的作用靶點上遇到瓶頸[16-18]。代謝組學(xué)是在高通量、高分辨率和高靈敏度的代謝分析平臺基礎(chǔ)上，通過高分辨質(zhì)譜等分析技術(shù)，采用多元統(tǒng)計分析方法全面分析生物樣品中的所有內(nèi)源性小分子代謝物，尋找并篩選和疾病相關(guān)的特異性代謝標(biāo)志物，分析其代謝途徑，利于闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及疾病的發(fā)病機制[19-21]。蛋白質(zhì)組學(xué)可基于二維電泳等技術(shù)與生物信息學(xué)工具，從蛋白質(zhì)水平上對蛋白質(zhì)的作用模式、功能機制等進行探索，研究特定條件下的蛋白質(zhì)整體水平的存在狀態(tài)與活動規(guī)律，能將復(fù)雜的中藥功效成分和蛋白質(zhì)的表達、修飾有機聯(lián)系起來[22-23]，篩選任何有意義的中藥功效成分，揭示機體對它的反應(yīng)途徑、進程與本質(zhì)，從而闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制[24-26]?；蚪M學(xué)可從分子水平、基因水平研究中藥在基因組上的作用靶點、作用規(guī)律以及中藥活性成分的片段基因，利于發(fā)掘中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[27]?；瘜W(xué)生物學(xué)在靶點發(fā)現(xiàn)策略包括化學(xué)探針和藥物的開發(fā)中都起到了關(guān)鍵作用，系統(tǒng)化學(xué)生物學(xué)可逆向篩選中藥中的有效成分[28]。點擊化學(xué)技術(shù)現(xiàn)已成為當(dāng)前的一大研究熱點，主要是通過小單元的拼接，快速準(zhǔn)確地完成形形色色分子的化學(xué)合成。如Ma等[29]論述了點擊化學(xué)技術(shù)在拓撲異構(gòu)酶Ⅱ抑制劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑、蛋白酪氨酸激酶抑制劑及抗菌藥物在抗癌藥物合成中的應(yīng)用。分子對接技術(shù)可對化學(xué)成分與直接靶標(biāo)的結(jié)合模式進行預(yù)測[30-31]，之后通過代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)與“核心靶標(biāo)”進行互作分析，可發(fā)現(xiàn)與核心靶標(biāo)直接作用的功效成分。

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是一個系統(tǒng)工程，有必要采用多學(xué)科交叉等方式，開拓思路，靈活運用以上技術(shù)，各有側(cè)重地發(fā)揮其優(yōu)勢，才可利于系統(tǒng)地闡釋中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)性，為中藥質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1.2 中藥功效分子起始事件——中藥功效關(guān)鍵事件——中藥功效結(jié)局概念框架的提出 AOP概念框架是用以概述已有的關(guān)于直接分子起始事件（如：外源化合物與特定生物大分子的結(jié)合）與在生物不同組織結(jié)構(gòu)層次（如：細胞、器官等）所出現(xiàn)的與危險度評定（如生存、發(fā)育等）相關(guān)的“有害結(jié)局”之間相互聯(lián)系的一個概念框架。它是一個可跨越多種生物結(jié)構(gòu)層次的一系列連續(xù)事件的生物組織，能連接起始事件與結(jié)局之間的內(nèi)容，不同的構(gòu)成主要取決于產(chǎn)生AOP或所關(guān)注危險度內(nèi)容（如：生存、發(fā)育等）的類型以及生物學(xué)信息的范圍。AOP的概念內(nèi)涵包含了起點到終點，即分子起始事件到有害結(jié)局的全部過程，能夠判定關(guān)鍵的不確定性和需要優(yōu)先研究的內(nèi)容[32-34]。依此，提出POP概念框架，即POP3個關(guān)鍵要素——功效分子起始事件（始動因素）、功效關(guān)鍵事件（功效進程拐點）及功效結(jié)局。

功效分子起始事件（始動因素）即基于分子水平的中藥功效結(jié)局的起始事件，其是開始中藥功效結(jié)局路徑時化學(xué)物與機體發(fā)生生化反應(yīng)的一個關(guān)鍵起始位置，從而引起的一系列更高效應(yīng)水平的事件[35-36]。功效關(guān)鍵事件（功效進程拐點）是連接中藥功效分子起始事件與中藥功效結(jié)局之間的多個層次生物組織上的有因果關(guān)系或某種相關(guān)關(guān)系的事件。即中藥在發(fā)揮功效的過程中，在一些中藥功效成分的作用下，疾病開始向著治療目的演變發(fā)展，這個時期稱為關(guān)鍵時期，在達此拐點時期前，停止用藥后會導(dǎo)致治療不徹底等現(xiàn)象[36-37]。中藥功效結(jié)局是在與一系列效應(yīng)水平事件相關(guān)聯(lián)的特定度內(nèi)容基礎(chǔ)上，用以判定關(guān)鍵的不確定性和需要優(yōu)先研究的內(nèi)容[38]。因此，本研究旨在通過中藥功效結(jié)局、中藥功效關(guān)鍵事件和中藥功效分子起始事件3個關(guān)鍵因素，系統(tǒng)地闡釋中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)機制研究，建立中藥功效進程，從而明確中藥的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)。

2 以祛風(fēng)濕類中藥為例，建立中藥功效進程動態(tài)機制的新方法

中醫(yī)將祛風(fēng)寒濕邪治療風(fēng)濕痹證為主的藥物稱為祛風(fēng)濕藥，其功效主治廣泛[39]。臨床上，風(fēng)濕類疾病包括：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、痛風(fēng)等百余種疾病，這些疾病多是慢性的難治性疾病，發(fā)病機制也尚未完全清楚，其病情反復(fù)、臟器受累等成為風(fēng)濕患者的困擾。但不同疾病的臨床特點各有不同，即使同一疾病也會因病情的嚴重程度、累及臟腑、用藥反應(yīng)等各有差異，且患者的體質(zhì)、性別、地域等亦不同。因此，臨床醫(yī)生在深刻了解患者病情的同時，須綜合考慮各項因素，制定出個體化的診療方案。但個體化的治療方案要求臨床醫(yī)生明確中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，才可精準(zhǔn)用藥，從而利于臨床治療和新藥研發(fā)[40-41]。

文獻顯示，祛風(fēng)濕類中藥治療類風(fēng)濕性疾病的功效成分（物質(zhì)基礎(chǔ)）主要包括：生物堿類、苷類、黃酮類、內(nèi)酯類、苯丙素類、醛酮類等[42]，研究發(fā)現(xiàn)這些功效成分在臨床上的廣泛應(yīng)用和治療效果基本是通過動物模型闡明和證實的，實驗方法單一，對祛風(fēng)濕類中藥的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究不深入。有關(guān)祛風(fēng)濕類中藥功效成分的作用機制研究較少，迫使臨床醫(yī)生在治療此類疾病時主要靠西藥維持，出現(xiàn)了藥物不良反應(yīng)大、患者不耐受等眾多后果，而中藥種類多且不良反應(yīng)小，可多成分、多靶點綜合治療，有著獨特的優(yōu)勢，因此應(yīng)從其基因?qū)用妗⒅委煱悬c等多方面深入研究[42-44]，建立更科學(xué)、系統(tǒng)的祛風(fēng)濕類中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)評價體系，以全面闡釋祛風(fēng)濕類中藥的功效進程、功效產(chǎn)生的始動因素，為中藥質(zhì)量控制提供依據(jù)，從而更好地服務(wù)于臨床。

針對當(dāng)前祛風(fēng)濕類中藥的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀，本研究根據(jù)POP概念框架，采取“top-down”策略，其是一種”自頂向下”的設(shè)計方法，它可由整體到局部，即從中藥功效結(jié)局出發(fā)到明確中藥功效成分（物質(zhì)基礎(chǔ)）的研究過程[45]。所謂“頂（to p）”是指以整體研究思路為基礎(chǔ)，從目標(biāo)功效結(jié)局開始展開研究，即針對不同的風(fēng)濕性疾病，設(shè)置合理的給藥方案，通過觀察相應(yīng)祛風(fēng)濕類中藥功效的檢測指標(biāo)，明確其功效和功效進程，依據(jù)關(guān)鍵檢測指標(biāo)-時量關(guān)系圖和關(guān)鍵節(jié)點的生理病理特征，確證其功效結(jié)局；而“下（d own）”則是指通過各項新技術(shù)，逐級確定低層次功效關(guān)鍵事件（功效進程拐點）并與特定功效分子起始事件（始動因素）相關(guān)聯(lián)[46]，即通過代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及“代謝物-蛋白質(zhì)”關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，初步發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)濕類中藥的功效進程拐點（功效關(guān)鍵事件），而后從基因?qū)用?、關(guān)鍵靶點等明確祛風(fēng)濕類中藥功效的關(guān)鍵事件和其與功效結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)；隨后在細胞層面篩選祛風(fēng)濕類中藥關(guān)鍵功效成分，應(yīng)用化學(xué)生物學(xué)技術(shù)考察祛風(fēng)濕類中藥關(guān)鍵功效成分的直接靶標(biāo)，利用分子對接技術(shù)預(yù)測其功效成分與直接靶標(biāo)的作用模式，借助可檢測基因表達等技術(shù)，初步發(fā)現(xiàn)“直接靶標(biāo)-功效關(guān)鍵事件-功效結(jié)局”的相關(guān)性，后通過基因改造技術(shù)，反向證實祛風(fēng)濕類中藥藥效進程中直接靶標(biāo)與其功效關(guān)鍵蛋白及功效結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)性，進一步確證祛風(fēng)濕類中藥的功效分子起始事件，從而構(gòu)建完善的祛風(fēng)濕類中藥功效POP概念框架，建立其功效進程動態(tài)機制的新方法，見圖1。

圖1 技術(shù)路線圖

3 展望

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的迅猛發(fā)展，中藥的安全和療效問題在國際化發(fā)展中日益突出。當(dāng)前中藥的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究評價指標(biāo)多為靜態(tài)效應(yīng)指標(biāo)，無法反映其功效發(fā)生的動態(tài)過程，且功效的始動因素不清楚。本研究建立了一套“top-down”的“功效結(jié)局-功效關(guān)鍵事件-功效分子起始事件的祛風(fēng)濕類中藥功效進程動態(tài)機制研究新策略，且充分考慮了中藥的特殊性，靈活地將化學(xué)生物學(xué)、分子對接技術(shù)和組學(xué)技術(shù)等相互結(jié)合，應(yīng)用于中藥功效與物質(zhì)基礎(chǔ)的研究中。本研究以祛風(fēng)濕類中藥為例，建立其功效POP框架，深刻闡釋其功效機制，為明確中藥的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一項新的適宜模塊化方法。