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        糞腸球菌R-WL發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

        2019-04-27 05:19:36胡紅偉麻嘯濤閆凌鵬陳茹茹張嬋娟楊京娥李自茹黨亞鵬
        中國飼料 2019年7期
        關(guān)鍵詞:生長

        胡紅偉,麻嘯濤,閆凌鵬,陳茹茹,張嬋娟,楊京娥,李自茹,黨亞鵬,任 帥

        (山西大禹生物工程股份有限公司,山西運(yùn)城 044600)

        糞腸球菌(Enterococcus faecalis)是乳酸菌中的一類,屬于鏈球菌科腸球菌屬,是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性球菌,鏈狀排列,無芽孢,兼性厭氧(Ben 等,2018;Amachawadi等,2018)。 糞腸球菌是人和動物腸道的一類重要菌群,可參與機(jī)體多種代謝活動(Hwanhlem 等,2017;Ba 等,2017)。 糞腸球菌可產(chǎn)生多種腸球菌菌素,對機(jī)體健康具有重要意義,另外,在菌種生長代謝過程中產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,如乳酸、乙酸、過氧化氫和甘露聚糖肽等,乳酸和乙酸可使腸道pH下降,拮抗病原菌的生長繁殖,過氧化氫和甘露聚糖肽等可殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌 (Allameh等,2017;Li等,2017;Chen 等,2017;Song 等,2016)。 糞腸球菌作為益生菌已經(jīng)在醫(yī)學(xué)和飼料領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用(Liu 等,2017;Zeng 等,2016;Perumal等,2016)。

        制備糞腸球菌高濃菌粉,需要使糞腸球菌菌體密度最大,但是糞腸球菌存在抗逆性差和培養(yǎng)后期自溶的缺點(diǎn)(Silva等,2013),因此,根據(jù)菌種生理特性,優(yōu)化效果最佳的培養(yǎng)條件和增菌培養(yǎng)基,能夠改進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程,有效利用培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分,獲得高密度培養(yǎng)的糞腸球菌菌體,從而降低生產(chǎn)成本(Liu 等,2014;Zhang等,2009)。

        本實(shí)驗(yàn)室前期從環(huán)境中分離得到一株乳酸菌R-WL,經(jīng)鑒定為糞腸球菌,為實(shí)現(xiàn)該糞腸球菌的工業(yè)化生產(chǎn),提高單位體積菌體密度,本研究在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,對糞腸球菌的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,利用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法 (Hassani等,2015;Yoo等,2008)優(yōu)化糞腸球菌 R-WL的培養(yǎng)基成分,旨在提高發(fā)酵培養(yǎng)基中單位體積的有效活菌數(shù),實(shí)現(xiàn)糞腸球菌的高密度培養(yǎng),為糞腸球菌活菌制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 供試菌種 糞腸球菌R-WL,本實(shí)驗(yàn)室分離,具有較好的益生特性。

        1.1.2 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉 5 g、磷酸氫二鉀 2 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、碳酸鈣 3 g、pH 6.8,水 1000 mL。115 ℃高壓滅菌20 min;此培養(yǎng)基用于菌種活化復(fù)壯。

        計數(shù)培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基成分中再加入2%瓊脂粉,煮沸后混合均勻,調(diào)節(jié)pH為6.2,115℃高壓滅菌20min,此培養(yǎng)基用于活菌計數(shù)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 菌種活化 取凍存甘油管糞腸球菌R-WL,于MRS試管活化24 h,平板計數(shù),挑單菌接入盛有100 mL液體MRS培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,置于恒溫?fù)u床37℃、120 r/min培養(yǎng)18 h,備用。

        1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將活化后的試管菌種按照2%的接種量接入各發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37℃、160 r/min條件下,培養(yǎng)14 h,檢測活菌數(shù)。

        1.2.3 活菌數(shù)含量測定 根據(jù)GB/T4789.35-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)食品中乳酸菌》,采用MRS平板菌落計數(shù)法,測定菌液中糞腸球菌活菌含量。

        1.3 試驗(yàn)設(shè)計

        好歹他們勤勞的本色不變:楊秋香該忙家務(wù)活兒還忙家務(wù)活兒,有時她也到超市幫忙干點(diǎn)雜活兒。楊力生該接待往來客戶,還是熱心地接待往來客戶,夫妻二人各盡其責(zé),但就是誰也不肯先理睬誰。

        1.3.1 生長曲線建立 取活化好的種子液,1%接種于盛有100 mL液體MRS培養(yǎng)基后,于37℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng),以空白MRS培養(yǎng)基為對照,將菌液用無菌MRS稀釋3倍測定初始濃度所對應(yīng)的吸光值OD600nm,每隔2 h測定一次,至48 h培養(yǎng)結(jié)束,以時間(h)為橫坐標(biāo),OD600nm為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。

        1.3.2 R-WL培養(yǎng)條件優(yōu)化

        1.3.2.1 糞腸球菌R-WL最適生長pH的測定取活化好的種子液,1%接種到40%裝液量 (250 mL三角瓶裝 100 mL)的不同 pH(pH=5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0) 的 MRS 培養(yǎng)基, 于 37 ℃、160 r/min培養(yǎng)14 h后測定活菌數(shù)。

        1.3.2.2 糞腸球菌R-WL最適生長溫度測定 將MRS培養(yǎng)基調(diào)整pH 8.5,然后將糞腸球菌以1%的接種量接種到裝液40%的MRS培養(yǎng)基中,分別置于不同溫度(T=33、35、37、39、41 ℃)的恒溫?fù)u床中,160 r/min培養(yǎng)14 h,測定活菌數(shù)。

        1.3.2.3 糞腸球菌R-WL最適接種量的測定 選擇不同接種量1%、2%、3%、5%、9%,接種到裝液量40%的MRS培養(yǎng)基中,調(diào)整pH 8.5,培養(yǎng)溫度37℃,160 r/min培養(yǎng)14 h,測定培養(yǎng)液活菌數(shù)。

        1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

        1.3.3.2 氮源的篩選 硫酸銨、蛋白胨、豆粕、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨+酵母膏(1∶1),以 10、20、30 g/L濃度替代MRS培養(yǎng)基中復(fù)合氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏),另設(shè)MRS培養(yǎng)基為對照組,250 mL三角瓶裝液量100 mL,37℃、160 r/min培養(yǎng)14 h后用MRS培養(yǎng)基計數(shù),做兩個平行。

        1.4 Plackett-Burman設(shè)計法篩選顯著影響因素Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計法通過分析每個影響因素的兩個水平,比較兩水平的差異和整體的差異,從而確定每個因素的顯著性,達(dá)到快速準(zhǔn)確篩選出主效因素的目的;根據(jù)培養(yǎng)基篩選出的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽后,進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。選取最佳碳源、最佳氮源、檸檬酸二銨、結(jié)晶乙酸鈉、檸檬酸氫二鉀、無水硫酸鎂和硫酸錳進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn),以篩選影響糞腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的3個顯著影響因子。

        1.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計模塊,每個顯著性因素取3個水平,以糞腸球菌R-WL活菌數(shù)對數(shù)值為響應(yīng)值,設(shè)計3因素3水平共15個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn),分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng),繪制等高線和響應(yīng)曲面,在一定范圍內(nèi)求出最佳值,得出最佳培養(yǎng)基配方。

        1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗(yàn)結(jié)果均以 “平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示,利用SAS 9.3軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA,LSD),P<0.05和P<0.01為數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上差異顯著。試驗(yàn)作圖采用Origin 9.0完成。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 糞腸球菌的生長曲線 根據(jù)所測菌液OD600值繪制糞腸球菌R-WL的生長曲線 (圖1),可以看到0~2 h菌體濃度上升較緩和,這是菌種進(jìn)入新環(huán)境的適應(yīng)階段,為該菌種的延滯期;2~14 h糞腸球菌菌體濃度快速生長至最高峰,該時期曲線基本接近直線,說明該時期是糞腸球菌生長最快的時期,為其對數(shù)生長期;14 h之后,菌液濃度變化比較穩(wěn)定,說明此時糞腸球菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期,選取14 h為該菌種最適培養(yǎng)時間。

        圖1 糞腸球菌R-WL生長曲線

        2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

        2.2.1 糞腸球菌R-WL最適生長pH的測定 菌種R-WL在不同pH培養(yǎng)基中的活菌數(shù)見圖2,初始pH為7.5、8、8.5和9.0時,活菌數(shù)較高,各組間差異不顯著(P>0.05),與其他pH組差異極顯著(P<0.01),活菌數(shù)最高的pH為8.5,最終菌體濃度為3.8×109cfu/mL,說明隨著培養(yǎng)基初始pH的升高,菌種后期所產(chǎn)乳酸的中和能力增強(qiáng),減輕了乳酸對菌體的毒害作用,因此,確定該糞腸球菌最適pH為8.5。

        圖2 不同初始pH對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

        2.2.2 糞腸球菌R-WL最適生長溫度的測定 由圖3可知,不同溫度之間最終活菌數(shù)差異不顯著(P>0.05),說明菌株R-WL在37~41℃具有較強(qiáng)的適應(yīng)性,隨著溫度升高,活菌數(shù)先升高后下降,溫度在37℃時,菌種R-WL活菌數(shù)最高,達(dá)到3.96×109cfu/mL,說明溫度對菌種的生長具有一定影響,該菌種在溫度為37℃時,菌種的代謝最為旺盛,對營養(yǎng)物質(zhì)利用率提高,進(jìn)而提高最終活菌數(shù)。因此,確定糞腸球菌R-WL最適溫度為37℃。

        圖3 不同培養(yǎng)溫度對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

        2.2.3 糞腸球菌R-WL最適接種量的測定 由圖4可知,不同接種量之間活菌數(shù)在P=0.01水平上差異不顯著,隨著接種量的增加,糞腸球菌RWL活菌數(shù)先升高后下降,在3%接種量時,活菌數(shù)達(dá)到最大值,為3.36×109cfu/mL,與1%接種量活菌數(shù)差異不顯著(P>0.05),但活菌數(shù)顯著高于其他各組(P<0.05),原因可能是,隨著接種量的增加,縮短了菌種R-WL的延滯期,促進(jìn)了菌種迅速進(jìn)入對數(shù)期,但隨著接種量超過5%以后,由于初始接種量過大,帶入較多菌種次級代謝產(chǎn)物,反而抑制了菌種的生長,因此,綜合考慮,選取3%為最適接種量。

        2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

        2.3.1 碳源篩選試驗(yàn) 由圖5可知,乳糖做碳源時,與玉米粉、麩皮、糖蜜、蔗糖及可溶性淀粉各組活菌數(shù)差異極顯著(P<0.01),與對照組(葡萄糖)差異不顯著(P>0.05),乳糖各濃度之間活菌數(shù)差異不顯著(P>0.05),以麩皮和可溶性淀粉做碳源時,活菌數(shù)顯著小于其他各組(P<0.05);說明菌種R-WL能較好利用葡萄糖或乳糖,對麩皮和可溶性淀粉中的多糖較難利用,根據(jù)活菌數(shù)情況,選擇最適碳源為乳糖,最適濃度為10 g/L。

        圖4 不同接種量對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

        圖5 不同碳源及其濃度對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

        2.3.2 氮源篩選試驗(yàn) 由圖6可知,對照組、蛋白胨組及蛋白胨+酵母膏組活菌數(shù)大于豆餅粉組、豆粕組、花生餅粉組及硫酸銨組,蛋白胨+酵母膏組、蛋白胨組最高活菌數(shù)為3.40×109cfu/mL及3.21×109cfu/mL,豆餅粉、豆粕、花生餅粉及硫酸銨組活菌數(shù)最高分別為 0.43×109、0.38×109、0.64×109、0.07×109cfu/mL, 極顯著低于蛋白胨+酵母膏組、蛋白胨組和對照組(P<0.01);說明菌株R-WL對動物性氮源利用較充分,對植物性氮源及無機(jī)氮源的利用效果較差,動物性有機(jī)氮源中含有糞腸球菌R-WL生長所需氨基酸等物質(zhì),植物性氮源的氨基酸組成與菌株R-WL的生長需求不一致,無機(jī)氮源需要經(jīng)微生物代謝轉(zhuǎn)化才能合成菌株所需氨基酸;蛋白胨+酵母膏組活菌數(shù)高于其他各組,與對照組差異不顯著(P>0.05),選取蛋白胨+酵母膏為最適氮源,最適濃度為30 g/L。

        圖6 不同氮源及其濃度對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

        2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果,將篩選到的最佳碳源乳糖、最佳氮源酵母膏+蛋白胨代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖、復(fù)合氮源作為優(yōu)化培養(yǎng)基的成分,并將乳糖、酵母膏、蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、碳酸鈣共9個因子作為Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計的基本因素,另設(shè)2個虛擬變量估計試驗(yàn)誤差,各因子取高低2個水平,響應(yīng)值為單位體積糞腸球菌活菌數(shù)的對數(shù)值(Y),試驗(yàn)設(shè)計見表1,其中F與L為虛擬項(xiàng),試驗(yàn)結(jié)果見表2。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,可得各因子的效應(yīng)及其顯著性(表3),由表3可知,在糞腸球菌R-WL培養(yǎng)過程中,在α=0.1水平上,蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的對數(shù)值影響顯著,其中檸檬酸二銨為正效應(yīng),蛋白胨和乙酸鈉為負(fù)效應(yīng),因此將這3個因子做Box-Behnken試驗(yàn)。

        表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計

        表2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

        表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計各因子效應(yīng)及顯著性

        2.5 最陡爬坡試驗(yàn)及結(jié)果 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選結(jié)果,選取蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸銨為三個顯著性因子進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)以獲取活菌數(shù)最高的區(qū)域,根據(jù)各因子的系數(shù)及實(shí)際情況,設(shè)置4個梯度,結(jié)果如表4所示,梯度0+2Δ所對應(yīng)的活菌數(shù)最高,故采用蛋白胨11 g/L、乙酸鈉4 g/L、檸檬酸二銨4 g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

        表4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

        2.6 響應(yīng)面設(shè)計確定顯著影響因素的最佳值采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計,對蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨的濃度配比進(jìn)行優(yōu)化,以活菌數(shù)的對數(shù)值為響應(yīng)值,各因子設(shè)置3個水平(見表5),優(yōu)化結(jié)果如表6所示。

        表5 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及其編碼

        表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

        根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)結(jié)果,采用Design Expert 8.06軟件響應(yīng)面分析程序?qū)ζ溥M(jìn)行回歸擬合,得到二次多元回歸模型為:Y=9.77+0.040A+0.037B+0.01C+0.01AC+0.01BC-0.042A2-0.017B2-0.013C2(Y為活菌數(shù)對數(shù)預(yù)測值,A、B、C分別代表蛋白胨、乙酸鈉和檸檬酸二銨),對所得回歸方程進(jìn)行方差分析 (表7),可知:模型P值為0.0042,回歸項(xiàng)極顯著(P<0.01),表明本模型是有效的;失擬項(xiàng)P值為0.2301,失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),表明本模型不存在失擬現(xiàn)象;試驗(yàn)的精確度以變異系數(shù)(CV)表示,CV值越低,試驗(yàn)可靠性越強(qiáng),本試驗(yàn)CV值為0.16%(表8),說明試驗(yàn)結(jié)果可信,R2Adj為89.88%,表明響應(yīng)面89.88%的變化可以用此回歸模型進(jìn)行解釋,該模型與實(shí)際變化擬合較好,可用于糞腸球菌R-WL培養(yǎng)基優(yōu)化的預(yù)測。

        表7 回歸擬合方程方差分析

        表8 模型可信度分析

        利用Design Expert 8.06軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析,繪制活菌數(shù)對數(shù)值的等高線和曲面圖(圖7~圖9),等高線圖的圓心越接近橢圓表示交互作用越強(qiáng),等高線的稀疏表示響應(yīng)面圖形的平陡。從3組圖中可以直觀看出活菌數(shù)對數(shù)值存在最大響應(yīng)值,利用Design Expert 8.06軟件的Optimization模塊,對響應(yīng)值求極值,得出蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨添加量分別為12.18、4.5、4.5 g/L時,糞腸球菌R-WL的活菌數(shù)對數(shù)值存在最大值9.81221,所對應(yīng)的活菌數(shù)為6.46×109cfu/mL。

        圖7 蛋白胨和乙酸鈉交互影響對糞腸球菌RWL活菌數(shù)的等高線和曲面圖

        圖8蛋白胨和檸檬酸二銨交互影響對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的等高線和曲面圖

        圖9乙酸鈉和檸檬酸二銨交互影響對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的等高線和曲面圖

        2.7 最優(yōu)配方驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)?zāi)P偷目煽啃?,將?yōu)化后的培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基),在相同條件下進(jìn)行5次搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見圖10,優(yōu)化后培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基所得活菌數(shù)分別為(6.44±0.10)×109cfu/mL 和(3.76±0.17)×109cfu/mL,優(yōu)化后結(jié)果與預(yù)測值接近,可見模型能較好預(yù)測發(fā)酵液活菌數(shù)。

        圖10 優(yōu)化前后培養(yǎng)基活菌數(shù)變化

        3 討論

        3.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化 乳酸菌培養(yǎng)過程中,利用培養(yǎng)基中的糖類發(fā)酵為乳酸,糞腸球菌培養(yǎng)后期,乳酸大量積累,對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用,為減輕培養(yǎng)過程中高酸環(huán)境對菌體的毒害,經(jīng)常在培養(yǎng)過程中加入堿性物質(zhì)中和。許多研究表明,添加中和劑是提高乳酸菌活菌數(shù)的一個有效手段(閔偉紅等,2009;張廣敏等,2009)。 本研究通過調(diào)節(jié)初始pH來研究糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的變化,發(fā)現(xiàn)隨著pH升高活菌數(shù)升高,到一定程度開始下降,原因可能是較高的pH能中和發(fā)酵過程中更多的有機(jī)酸,有利于菌種的生長。

        溫度是微生物生長過程中的一個重要影響因素,改變溫度會影響微生物體內(nèi)所進(jìn)行的多種化學(xué)反應(yīng)(Lopes等,2018)。本試驗(yàn)在33~41℃,對培養(yǎng)糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的變化進(jìn)行了研究,雖然各組活菌數(shù)差異不顯著(P>0.05),隨著溫度升高,活菌數(shù)有先上升后下降趨勢,與劉香英等(2018)的研究結(jié)果一致。溫度過高或過低可能會出現(xiàn)菌種R-WL生物合成量過低及生長延長等不良現(xiàn)象,微生物代謝的蛋白酶、淀粉酶等酶制劑活力受溫度影響,適宜的溫度能促進(jìn)酶活力的發(fā)揮,有效利用營養(yǎng)物質(zhì),從而促進(jìn)菌體密度的提高。

        3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 碳源是微生物生長所需的重要營養(yǎng)要素,也是微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳來源的營養(yǎng)物質(zhì)(岑沛霖等,2011),不同微生物利用碳源的能力不同。本試驗(yàn)研究了乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜、玉米粉和麩皮作為碳源時對菌種R-WL生長的影響,發(fā)現(xiàn)乳糖、葡萄糖對菌種的促生長效果較好,麩皮、可溶性淀粉、玉米粉的效果較差,原因可能是菌種RWL對單糖和雙糖利用較快,而麩皮、淀粉和玉米粉等多糖需要微生物產(chǎn)淀粉酶分解為二糖或單糖進(jìn)行利用,菌種R-WL產(chǎn)酶能力較差導(dǎo)致對多糖的利用不充分,菌種生長受到抑制。

        氮是組成核酸和蛋白質(zhì)的重要元素,其對微生物的生長發(fā)育有著重要作用。不同微生物能利用的氮源差異較大。本試驗(yàn)分別研究了6種氮源對菌種R-WL的促生長效果,結(jié)果表明,蛋白胨+酵母膏組的活菌數(shù)最高,這與Djellouli等(2017)與 Kwon等(2000)研究結(jié)果相似。 蛋白胨、酵母膏中的氮以氨基酸形式存在,氨基酸可以被微生物直接吸收參與細(xì)胞代謝,而豆粕、豆餅粉、花生餅粉以蛋白質(zhì)形式存在,需要分解為氨基酸才能利用,糞腸球菌為異氧型微生物,對硫酸銨中的無機(jī)氮無法利用,可能是菌株R-WL在豆粕、豆餅粉、花生餅粉及硫酸銨中活菌數(shù)較低的原因。

        3.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 響應(yīng)面法(RSM),也稱響應(yīng)曲面法,是通過對應(yīng)曲面及等高線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù),用多元二次回歸方程來擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計方法(Montgomery 等,2009;Box,1990)。 試驗(yàn)證明,Plackett-Burman設(shè)計與響應(yīng)面方法(RSM)相結(jié)合的試驗(yàn)統(tǒng)計方法能快速、有效地影響糞腸球菌R-WL液體培養(yǎng)的因素,并將顯著性因素進(jìn)行建模分析,得到最佳工藝參數(shù)。

        4 結(jié)論

        本試驗(yàn)結(jié)果表明,糞腸球菌R-WL最適培養(yǎng)條件為:時間14 h、pH 8.5、溫度37℃、接種量3%、最佳碳源為乳糖、最佳氮源為蛋白胨+酵母膏。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為:乳糖10 g/L、酵母膏15 g/L、蛋白胨 12.18 g/L、乙酸鈉 4.5 g/L、檸檬酸二銨4.5 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、輕質(zhì)碳酸鈣3 g/L,初始pH 8.5。將此優(yōu)化后培養(yǎng)基與原MRS培養(yǎng)基在最適培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng),所得活菌數(shù)分別為(6.44±0.10)×109cfu/mL 和(3.76±0.17)×109cfu/mL,比優(yōu)化前活菌數(shù)提高了71.28%。

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