張 園 ，徐紹忠 ，毛自朝，林 春，劉正杰

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術(shù)學院,昆明 650201； 2.云南省高校作物種質(zhì)創(chuàng)新及可持續(xù)利用重點實驗室,昆明 650201)

WD40結(jié)構(gòu)域首次發(fā)現(xiàn)于G蛋白β亞基，WD40蛋白家族一般都含有1個以上的從谷氨酸-組氨酸(Gly-His)開始、到色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asp)結(jié)尾的WD40結(jié)構(gòu)域，又被稱之為WD-重復(WD-repeat)蛋白[1]。WD40蛋白家族在真核生物中相當保守，基于內(nèi)部WD40 基序與其他蛋白之間互作(如E3泛素連接酶復合體CUL4-DDB1-DWD[2])，參與多種細胞生物學和生理化學過程，包括信號轉(zhuǎn)導、細胞轉(zhuǎn)運、組蛋白甲基化、RNA加工、花的發(fā)育和泛素化等[3-5]。

在植物中，WD40蛋白參與多種代謝和調(diào)控途徑，包括植物花青素合成與調(diào)控、植株形態(tài)發(fā)育調(diào)控，以及各種響應多種非生物脅迫過程等[6]。擬南芥基因組中存在269個含有WD40結(jié)構(gòu)域的基因[7]，研究發(fā)現(xiàn)部分基因參與對擬南芥花的形成和種子發(fā)育過程的調(diào)控[8]，而一些基因在信號轉(zhuǎn)導過程中有重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻中SRWD(SALT RESPONSIVE WD40 PROTEIN)亞家族中，有5個成員應答鹽脅迫產(chǎn)生的反應[10]。植物處于在非生物脅迫逆境條件下，在植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列的生理代謝反應，表現(xiàn)為生長和代謝受抑制，甚至導致植株的死亡，其中鹽堿等逆境危害，是目前普遍存在于自然界導致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要因素[11]。

目前，在番茄中已報道發(fā)現(xiàn)了100個WD40蛋白亞家族DWD蛋白，這些蛋白的主要作用是作為E3泛素連接酶CUL4復合體中的亞基識別底物[12]。相關(guān)研究表明，番茄WD40蛋白可參與響應非生物脅迫的過程，番茄SlWD6基因的過量表達可顯著增強番茄的抗旱和耐鹽功能[13]；SlWDR141基因?qū)}脅迫和細菌侵染均起正調(diào)控作用[14]。但目前尚未見到有關(guān)紫色番茄WD40蛋白功能研究的報道。為了研究紫色番茄中WD40蛋白編碼基因在抗逆方面的作用，應用RT-PCR的方法從紫色番茄品種‘硯紫1號’葉片中克隆了SlWD40-like基因，通過qRT-PCR手段分析目的基因的組織表達特異性，利用qRT-PCR方法明確該基因在逆境脅迫下的表達模式，為該基因的功能鑒定和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

紫色番茄品種‘硯紫1號’由云南省硯山縣蔬菜研究所提供。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由云南農(nóng)業(yè)大學特色小宗作物研究中心實驗室保存。pMD18-T載體、Taq酶購置于TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生物有限公司。引物合成與測序由上海生物工程有限公司完成。其他試劑分析純購自昆明云科生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 供試樣品總RNA的提取采用天根生物有限公司試劑盒，根據(jù)Invitrogen公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后置于-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.2 紫色番茄SlWD40-like基因克隆 基于文獻報道的與逆境響應相關(guān)WD40蛋白編碼基因保守序列(含結(jié)構(gòu)域)，在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對番茄EST庫Blast比對，將獲得的高度相似性的EST序列拼接成較長的復合EST，再以此復合EST為查詢序列再次進行Blast比對和拼接，直到最有效延伸。NCBI在線ORF Finder工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測候選基因序列開放閱讀框，設(shè)計特異引物(表1)SlWD40F1和SlWD40R1，以葉片cDNA為模板進行PCR擴增，PCR體系參考文獻[15]。擴增條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，然后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取經(jīng)鑒定的陽性克隆，送樣測序。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Primers used in this research

1.2.3SlWD40-like基因編碼的氨基酸序列特征分析 Protparam在線軟件(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protpara)預測氨基酸序列等電點和分子量等理化性質(zhì)；NCBI在線CDD工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd)預測氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域；ProtScale在線軟件(https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析蛋白質(zhì)的親水性/疏水性；NetPhos 3.1 Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測氨基酸序列翻譯后的磷酸化修飾；SOPMA 在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；DNAman軟件進行氨基酸多序列比對；MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 供試材料鹽脅迫處理 挑選飽滿的‘硯紫1號’種子，先浸在涼水中4～5 h，取出后放入質(zhì)量分數(shù)為10%的磷酸三鈉溶液中消毒20 min，取出用清水洗凈，置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)出苗，然后將幼苗移栽至育苗盤中，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。挑選長勢較為一致且健壯的番茄幼苗，置于1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d，然后在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中加入NaCl，使NaCl濃度達到150 mmol·L-1[13]。分別取鹽脅迫處理0、3、6、12、24和48 h的植株的相同部分葉片，每個處理時間取3個生物學重復樣品，樣品用液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.5 供試材料干旱脅迫處理 供試材料的前期處理與 “1.2.4”一致。挑選光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后的健壯番茄植株移栽至花盆，移栽成活后，連續(xù)7 d不澆水(此時極度萎蔫)，其中對停水當天(0 d)、1 d、3 d、5 d和7 d及復水1d(Re1d)植株相同部分的葉片取樣，每個處理時間取3個生物學重復樣品，樣品速凍于液氮后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.6 供試材料ABA和MeJA處理 供試材料前期處理同“1.2.5”，挑選長勢較為一致且健壯的番茄幼苗30株移栽至花盤，5 d后分別用于ABA和MeJA誘導處理試驗。一組在供試材料葉片噴施100 μmol·L-1的ABA[16]，分別取ABA處理0、1、3、6、12和24 h植株相同部分的葉片，每個處理時間取3個生物學重復樣品，樣品速凍于液氮后保存在-80 ℃冰箱。另一組在供試材料葉片噴施200 μmol·L-1MeJA[16]，分別取MeJA處理0、1、3、5、7和9 h植株相同部分的葉片，每個處理時間取3個生物學重復樣品，樣品速凍于液氮后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.7SlWD40-like基因定量Real-time PCR分析 提取紫色番茄根、莖、葉、花、青果和紫果，以及上述不同處理、不同時間的供試樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA，以番茄UBI3持家基因(登錄號：X58253)作為內(nèi)參基因，基于引物qUBI3F1、qUBI3R1和qWD40F1、qWD40R1進行上述組織部位樣品定量Real-time PCR分析，每個反應重復3次，基因相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlWD40-like基因的克隆

以紫色番茄cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，經(jīng)電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化和測序，獲得目的基因序列(圖1)，測序結(jié)果表明，目的基因的開放閱讀框(ORF)全長1 383 bp，編碼460個氨基酸殘基，氨基酸序列中包含6個保守的WD40重復基序，屬于典型的WD40基因家族，因此將目的基因命名為SlWD40-like基因。

2.2 SlWD40-like蛋白生物信息學分析

2.2.1 SlWD40-like蛋白理化性質(zhì)分析 Protparam等在線軟件分析表明，SlWD40-like蛋白分子質(zhì)量為51.0 ku，分子式為C2242H3505N641O691S16，含有43個負電荷氨基酸殘和53個正電荷氨基酸殘基，理論等電點為9.04；不穩(wěn)定系數(shù)為44.43，屬不穩(wěn)定型蛋白。由ProtScale工具分析可知，SlWD40-like蛋白親水性區(qū)域(分值為負)分值較高，但疏水性區(qū)域(分值為正)分值低，因此推測該蛋白屬于親水性蛋白。

M. DNA marker 2000; 1～2. RT-PCR擴增產(chǎn)物 RT-PCR products

圖1SlWD40-like基因RT-PCR擴增
Fig.1RT-PCRamplificationofSlWD40-like

2.2.2 SlWD40-like蛋白序列翻譯后的磷酸化修飾預測 蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白翻譯后最為普遍和常見的一種修飾方式。一般來說，氨基酸鏈中潛在的磷酸化位點越多，則該蛋白能夠發(fā)揮重要作用的可能性也就越大[17]。NetPhos軟件在線分析表明,SlWD40-like存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3個磷酸化位點。各個磷酸化位點的數(shù)目存在差異，其中絲氨酸磷酸化位點42個，蘇氨酸磷酸化位點15個，酪氨酸磷酸化位點8個。

2.2.3 SlWD40-like蛋白結(jié)構(gòu)分析 NCBI的CDD在線工具預測發(fā)現(xiàn)，SlWD40-like蛋白的連續(xù)6個WD40重復基序位于開放閱讀框的319～127 5之間，說明SlWD40-like蛋白屬于WD40超級家族。用SOPMA預測表明，SlWD40-like蛋白二級結(jié)構(gòu)含有12.61%的α螺旋，7.17%的β轉(zhuǎn)角，延伸鏈占28.04%，無規(guī)則卷曲占據(jù)比例達52.17%。

2.2.4 不同物種間WD40蛋白的同源性與進化分析比較 將紫色番茄SlWD40-like蛋白與潘那利番茄、胡蘿卜、擬南芥等物種中WD40蛋白進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)物種之間WD40蛋白序列的同源性較高，特別是在重復的WD-repeat區(qū)域高度保守(圖2)。將紫色番茄SlWD40-like蛋白與一些雙子葉植物和單子葉植物的WD40蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)SlWD40-like蛋白與潘那利番茄的WD40蛋白親緣關(guān)系最近，其次是胡蘿卜(圖3)。從整個進化樹結(jié)構(gòu)來看，系統(tǒng)進化分析將所有蛋白序列分為3個分枝(CladeⅠ～CladeⅢ)，其中SlWD40-like蛋白與潘那利番茄和胡蘿卜的WD40蛋白序列在同一個分枝。

2.3 SlWD40-like基因的表達分析

應用熒光定量RT-PCR方法對SlWD40-like基因進行組織特異表達分析表明，SlWD40-like基因在營養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達，在營養(yǎng)器官中，根部表達量較低，葉片表達量高，其次是莖；在生殖器官中，花的表達量較低，紫色果實中表達量高，其次是青果(圖4)。為進一步研究SlWD40-like基因是否受非生物脅迫誘導表達，本研究對紫色番茄苗期進行了鹽脅迫、干旱脅迫和外源ABA及MeJA激素處理，研究發(fā)現(xiàn)SlWD40-like基因受到NaCl、干旱、ABA和MeJA脅迫誘導：NaCl處理12 h，SlWD40-like基因表達量達到最高，隨后表達量降低；干旱處理條件下，SlWD40-like基因的表達受到干旱處理的顯深藍色、粉紅色、藍色和黃色分別代表同源性水平在100%、75%、50%和33%以上 Dark blue,pink,blue and yellow represent the level of homology at 100%,75%,50% and 33%,respectively；比對的物種為紫番茄 WD40 sequences obtained fromSolanumlycopersicum; 野生番茄Solanumpennellii； 胡蘿卜Daucuscarota; 土瓶草Cephalotusfollicularis; 蓖麻Ricinuscommunis; 陸地棉Gossypiumhirsutum; 毛果楊Populuseuphratica; 擬南芥Arabidopsisthaliana著誘導，特別是3 d和7 d時，表達量達到最高，復水1 d后又有所下降；ABA處理下，SlWD40-like基因表達量在1 h時達到最高，之后基因表達量顯著下降；而在MeJA處理下，SlWD40-like基因表達量在前3 h無顯著變化，但在5 h時達到最高(圖5)。

圖2SlWD40-like與其他物種同源蛋白質(zhì)的多序列比對
Fig.2Multi-alignmentofSlWD40-likeaminoacidsequencewithotherWD40s

圖3 紫色番茄與其他物種WD40蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.3 Molecular phylogenetic analysis of WD40 proteins from purple tomato and other species

R.根 Roots; S.莖 Stems;L.葉 Leaves;F.花 Flower;GF.青果 Green fruits;PF.紫果 Purple fruits

圖4SlWD40-like基因組織特異表達分析
Fig.4AnalysisoftissuespecificexpressionofSlWD40-likegene

3 討 論

基于同源克隆策略，設(shè)計引物進行RT-PCR擴增獲得紫色番茄中SlWD40-like基因cDNA序列，對其序列特征進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因長度為1 383 bp，編碼1條460個氨基酸多肽。氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，SlWD40-like基因編碼氨基酸序列與潘那利番茄、胡蘿卜、蓖麻和擬南芥等物種中的WD40重復蛋白序列高度同源，因此推測SlWD40-like基因編碼的蛋白為WD40重復蛋白。

WD40蛋白從多種層面參與對植物生命活動的調(diào)節(jié)[18]。近年來，隨著氣候演變趨于惡劣，鹽堿、干旱、高溫等非生物逆境脅迫對農(nóng)作物的影響越來越突出與加重[19]，關(guān)于探索農(nóng)作物的抗逆機制的研究也越來越受到重視[20]。諸多研究表明，WD40蛋白參與了各種非生物脅迫的響應，如干旱、鹽以及不同激素的誘導等。研究發(fā)現(xiàn)，將棉花GhWD40基因在擬南芥中超量表達可使種子在萌發(fā)期對脫落酸(ABA)更加敏感，但在幼苗期對ABA敏感性降低[21]。構(gòu)建小麥TaWD40D基因干涉載體并轉(zhuǎn)化小麥后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因材料對干旱的耐受性比野生型要低；而將TaWD40D基因過量表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥，則發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料對ABA、干旱和鹽等非生物脅迫的耐受性比野生型要高[22]。紅麻HcWD40-1基因受鹽和干旱脅迫誘導表達，同時受脫落酸和茉莉酸甲酯的誘導[20]。黑果枸杞WD40編碼基因LrAN11在鹽脅迫下表達量發(fā)生顯著變化，說明該基因可能參與黑果枸杞對鹽脅迫的響應[23]。

該研究發(fā)現(xiàn)，SlWD40-like基因表達受NaCl脅迫誘導，特別是在3～12 h期間，基因的表達量逐漸達到最高，隨后表達量開始下降；而在干旱脅迫處理下的第3天和第7天，SlWD40-like基因表達量顯著上調(diào)，表明SlWD40-like基因參與了紫色番茄耐鹽和抗旱的應答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，易受到NaCl和干旱脅迫誘導，這為紫色番茄后續(xù)的耐鹽和抗旱調(diào)控機制的剖析奠定了研究基礎(chǔ)。研究表明，植物在響應鹽脅迫和干旱的過程中，脫落酸和茉莉酸甲酯等重要的內(nèi)源激素迅速合成，可通過調(diào)節(jié)不同的生理生化途徑，包括使葉片氣孔關(guān)閉等，來提升植物耐鹽的能力[24]。外源施加ABA能提升內(nèi)源ABA合成水平，進而促進植物耐受非生物脅迫的能力[25]。在本研究中，對紫色番茄進行外源ABA和MeJA都能夠誘導葉片中SlWD40-like基因表達，特別是在ABA處理1 h和MeJA處理5 h下，均有一個較高的應答反應，基因表達量迅速提高，說明SlWD40-like基因參與了脫落酸和茉莉酸甲酯信號通路下非生物脅迫應答途徑。

圖5 NaCl(A)、干旱(B)、ABA(C)和MeJA(D)脅迫下 SlWD40-like基因的表達量Fig.5 Expression of SlWD40-like gene under stress treatment of NaCl(A),drought(B),ABA(C) and MeJA(D)

前人研究發(fā)現(xiàn)，花青素等次生代謝物質(zhì)在應對各種生物及非生物脅迫方面具有積極意義[26]。該研究中qRT-PCR分析表明SlWD40-like基因?qū)儆诮M成型基因，但在紫色較深的莖、葉和成熟紫果中表達量較高，這說明SlWD40-like基因的表達可能與紫色番茄花青素的合成存在一定關(guān)聯(lián)，但SlWD40-like基因的表達與抗鹽性以及花青素含量之間的具體關(guān)系與作用機制，還需要后續(xù)進一步研究證實。

4 結(jié) 論

本研究從紫色番茄中克隆了一個編碼屬于WD40重復蛋白家族的基因SlWD40-like，該基因編碼個460氨基酸，具有6個典型的WD40結(jié)構(gòu)域。該基因在紫色番茄器官中組成性表達，但存在表達量上的差異性；受鹽和干旱脅迫誘導表達，同時受ABA和MeJA的誘導。以上結(jié)果表明，SlWD40-like基因同時受上述脅迫誘導表達，可能是ABA和MeJA等信號轉(zhuǎn)導途徑及鹽和干旱脅迫應答途徑的關(guān)鍵樞紐基因，這為紫色番茄耐鹽的脫落酸信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供了一定的理論依據(jù)。