許達(dá)為，曹 凱,2，鄒佳寧，王昊天，鄒志榮

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北設(shè)施園藝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游設(shè)施農(nóng)業(yè)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

開花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)過(guò)渡的重要階段。在被子植物和裸子植物中均發(fā)現(xiàn)磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)，它們是一類既能促進(jìn)開花又能抑制開花的因子，可以分為3個(gè)亞家族，分別為FT-like亞家族、TFL1-like亞家族和MFT-like亞家族[1-2]。

FT-like亞家族作為PEBP家族中的重要成員，在控制開花時(shí)間、花序發(fā)育和產(chǎn)量方面產(chǎn)生重要影響。FT-like蛋白促進(jìn)植物開花已經(jīng)在多個(gè)物種中得到證實(shí)，如楊樹(Populusspp)[3]、蘋果(Malusdomestica)[4]、甜菜(Betavulgaris)[5]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[6]、煙草(Nicotianatabacum)[7]和水稻(Oryzasativa)[8]。雖然幾乎所有FT-like蛋白都作為開花促進(jìn)因子起作用，但在甜菜和煙草中，有的促進(jìn)開花，有的抑制開花。甜菜中BvFT1蛋白在開花中起抑制作用，BvFT2蛋白起促進(jìn)作用[5]。在煙草的4個(gè)FT-like蛋白中，NtFT1、NtFT2和 NtFT3蛋白抑制開花，NtFT4蛋白促進(jìn)開花[7]。FT-like蛋白還會(huì)影響花的發(fā)育，番茄SFT基因是擬南芥FT的同源基因，番茄sft突變體只有1～2朵花，且花萼葉片化。番茄中過(guò)表達(dá)SFT基因，番茄合軸分枝的葉片數(shù)從3片降低到2片[9-10]。FT-like蛋白通過(guò)參與源庫(kù)調(diào)控改變果實(shí)性狀和產(chǎn)量指標(biāo)，在大豆(GlycinemaxL.)中，開花促進(jìn)因子GmFT和開花抑制因子GmTFL1的相對(duì)含量協(xié)調(diào)了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)的關(guān)系，從而調(diào)控了開花時(shí)間和開花后莢果的發(fā)育[11-13]。番茄成熟葉片中SFT基因合成的成花素物質(zhì)，可以通過(guò)篩管細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到庫(kù)器官尤其幼葉中，影響庫(kù)器官的形成[14]。

目前，在番茄中已鑒定出4個(gè)表達(dá)的FT-like蛋白分別為SFT、SlSP5G、SlSP5G2和SlSP5G3[15]。其中SlSP5G3蛋白在番茄中與開花和果實(shí)產(chǎn)量相關(guān)的功能未知，為明確其生物學(xué)功能，本試驗(yàn)分析了SlSP5G3在番茄‘Micro-Tom’中的表達(dá)規(guī)律，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因分析初步發(fā)現(xiàn)SlSP5G3在調(diào)控番茄開花和產(chǎn)量方面發(fā)揮了重要作用，為揭示FT-like蛋白在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材樣品的獲得

試驗(yàn)材料為矮生番茄(SolanumlycopersicumL.)‘Micro-Tom’和SlSP5G3基因過(guò)表達(dá)株系。試驗(yàn)材料在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)部設(shè)施工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱(RDN-1000D-4，寧波東南儀器有限公司)中培養(yǎng)，栽培環(huán)境設(shè)定為：光照時(shí)長(zhǎng)12 h，光照強(qiáng)度100 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度25 ℃/18 ℃，相對(duì)濕度60%～70%。取野生型幼苗的根、莖、莖尖、花、子葉和真葉，用液氮速凍保存，用于RNA的提取。

1.2 植株總RNA 的提取及 SlSP5G3基因的表達(dá)水平分析

采用RNA試劑盒(Omega公司，中國(guó)廣州)提取番茄組織總RNA，采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司，中國(guó)大連)完成反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成。

qRT-PCR采用SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara公司，中國(guó)大連)，qRT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；融解曲線95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，冷卻40 ℃ 1 s，可以適當(dāng)?shù)卦黾友h(huán)數(shù)，獲得融解曲線數(shù)據(jù)，以番茄Actin基因作為內(nèi)參[16]，重復(fù)3次，然后采用公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物(表1)的合成及目的基因測(cè)序均由奧科鼎盛生物科技公司(中國(guó)楊凌)完成。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://solgenomics.net)里找到SlSP5G3(Solyc11g008650)的CDS序列，利用Vector NTI設(shè)計(jì)引物SlSP5G3-F1、SlSP5G3-R1通過(guò)PCR擴(kuò)增，兩端分別加入同源重組序列(圖1)，以番茄嫩葉的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收目的條帶。利用同源重組的方法連接到過(guò)表達(dá)載體pHellsgate8(澤葉生物科技有限公司，中國(guó)上海)中進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

將野生型番茄‘Micro-Tom’種子置于超凈工作臺(tái)上，清水浸泡10 min，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精清洗種子30 s，體積分?jǐn)?shù)為2%次氯酸鈉溶液震蕩15 min，滅菌水清洗種子2～3次。清洗過(guò)的種子接種到培養(yǎng)基中，移入西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院組織培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12 h，晝夜溫度為25 ℃/18 ℃，培養(yǎng)7～9 d至2片子葉完全展平后進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)化。參照葉志彪等[17]建立的番茄轉(zhuǎn)化體系并略有改動(dòng)，經(jīng)過(guò)侵染、篩選培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等過(guò)程獲得卡那霉素抗性植株。結(jié)合抗生素篩選、PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性苗目的基因表達(dá)水平，鑒定過(guò)表達(dá)植株。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株開花時(shí)間和上游基因的測(cè)定

選取野生型番茄‘Micro-Tom’(WT)和過(guò)表達(dá)株系(L8、L12)移入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上)，開花后隨機(jī)選取3株作為一組記錄開花所需的葉片數(shù)，取平均值。在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://solgenomics.net)里找到編碼FT-like基因上游轉(zhuǎn)錄因子基因SlSPCDF1(Solyc03g115940)、SlSPCDF2(Solyc05g007880)、SlSPCDF3(Solyc06g 069760)、SlSPCDF4(Solyc06g069760)、SlSPCDF5(Solyc02g088070)、TCOL1(Solyc02g089540)、TCOL2(Solyc02g895000)和TCOL3(Solyc02g089520)[18-19]的CDS序列，利用Vector NTI設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，操作方法同上。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株地上部干鮮質(zhì)量及產(chǎn)量的測(cè)定

在野生型番茄‘Micro-Tom’(WT)和T2代過(guò)表達(dá)株系(L8、L12)中隨機(jī)選取5株植株掛牌標(biāo)記，每株留3穗果打頂。試驗(yàn)結(jié)束后將植株地上部分按莖葉分開，采用萬(wàn)分之一天平稱量其鮮質(zhì)量。然后將稱量后的莖葉放在烘箱中80 ℃下72 h烘至恒量，采用萬(wàn)分之一天平稱量莖葉干質(zhì)量。果實(shí)成熟后，統(tǒng)計(jì)每株番茄的果實(shí)數(shù)量及單果質(zhì)量，計(jì)算單株產(chǎn)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表制作。

表1 構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和陽(yáng)性苗檢驗(yàn)引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study for plasmid construction,real-time fluorescent quantitative PCR and positive seedling check

圖1 植物超表達(dá)載體Phellsgate8示意圖Fig.1 Schematic representation of Phellsgate8 regions of 35S∷ SlSP5G3

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘Micro-Tom’過(guò)表達(dá)株系中 SlSP5G3的表達(dá)量檢測(cè)

通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含SlSP5G3基因的過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入番茄中。CTAB法提取獲得的8株再生植株的基因組DNA，通過(guò)陽(yáng)性苗檢驗(yàn)引物SlSP5G3-F3、SlSP5G3-R3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以不含目的基因的空質(zhì)粒(pHellsgate8)作為陽(yáng)性對(duì)照，野生型番茄‘Micro-Tom’植株基因組DNA(WT)為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示共有4株擴(kuò)增出長(zhǎng)度為222 bp的條帶，與目的條帶大小一致，即獲得4株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，分別為L(zhǎng)3、L8、L12、L14(圖2-A)。

進(jìn)一步確定目的基因的表達(dá)水平，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析野生型番茄‘Micro-Tom’和過(guò)表達(dá)株系L3、L8、L12、L14中SlSP5G3的表達(dá)量情況，發(fā)現(xiàn)L8和L12的表達(dá)量明顯高于野生型植株，分別增加了4.625倍和4倍，進(jìn)而選取L8和L12移入人工氣候箱(栽培環(huán)境同上)培育T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行后續(xù)的開花產(chǎn)量指標(biāo)測(cè)定。

2.2 SlSP5G3基因的表達(dá)規(guī)律

在野生型‘Micro-Tom’番茄提取cDNA中利用引物SlSP5G3-F和SlSP5G3-R，進(jìn)行目的基因SlSP5G3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。在日中性條件下，SlSP5G3的表達(dá)量隨光照時(shí)間變化，在開始光照時(shí)上升，在4 h時(shí)達(dá)到最大，在進(jìn)入黑暗后4 h達(dá)到最低(圖3-A)，推測(cè)SlSP5G3可以感受外界光信號(hào)。不同葉齡中SlSP5G3的表達(dá)量無(wú)明顯變化趨勢(shì)，說(shuō)明其不受生長(zhǎng)發(fā)育周期的影響(圖3-B)。在番茄植株中，真葉和子葉SlSP5G3表達(dá)量最高，莖、莖尖、花和根中基本不表達(dá)，說(shuō)明SlSP5G3的表達(dá)具有組織特異性(圖3-C)。

A.普通PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性苗 Detection of positive seedling in stransgenic plant by ordinary PCR；B.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SlSP5G3轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量 Detection of the expression level ofSlSP5G3in transgenic line by qRT-PCR

圖2轉(zhuǎn)基因幼苗的PCR檢測(cè)
Fig.2PCRfordetectionoftransgenicseedlings

A.SlSP5G3的表達(dá)量日變化 The variation of the expression level ofSlSP5G3throughout the day；B.植株由上至下8片葉SlSP5G3的表達(dá)量變化 The variation of expression ofSlSP5G3from the top 8 leaves of plants；C.不同器官SlSP5G3的表達(dá)量變化 The variation of expression ofSlSP5G3in different tissues

圖3SlSP5G3表達(dá)量變化規(guī)律
Fig.3ThevariationofexpressionofSlSP5G3

2.3 SlSP5G3對(duì)開花時(shí)間的影響

番茄生長(zhǎng)發(fā)育中每增長(zhǎng)一片葉的時(shí)間受環(huán)境因素影響較小約為4～6 d，故番茄的開花時(shí)間可以由開花前所需葉片數(shù)來(lái)衡量[20]。將T2代轉(zhuǎn)基因株系(L8、L12)和野生型番茄‘Micro-Tom’(WT)催芽后定植于人工氣候箱，栽培環(huán)境同上，記錄開花所需的葉片數(shù)。發(fā)現(xiàn)L8和L12開花時(shí)間明顯晚于WT(圖4-A，圖4-B)。數(shù)據(jù)分析L8、L12和WT開花所需葉片數(shù)顯示，與野生型番茄WT相比，L8和L12開花所需葉片數(shù)明顯增加，分別為2.34和2.67片。

2.4 SlSP5G3對(duì)上游開花相關(guān)基因TCOLs和SlCDFs的影響

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)T1代過(guò)表達(dá)株系(L8、L12)和野生型番茄‘Micro-Tom’(WT)上游TCOLs和SlCDFs的表達(dá)情況。L8、L12和WT中，SlCDF2的表達(dá)量最高，SlCDF3的表達(dá)量最低。相比于WT，過(guò)表達(dá)L8、L12明顯上調(diào)了SlCDF3的表達(dá)量，分別增加了4.50倍和9.61倍(圖5-A)；在L8、L12和WT中，TCOL1的表達(dá)量最高，TCOL3的表達(dá)量最低，但與WT相比，L8和L12并無(wú)明顯的變化趨勢(shì)。

2.5 SlSP5G3對(duì)番茄地上部生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響

SlSP5G3基因過(guò)表達(dá)對(duì)番茄植株地上部形態(tài)及產(chǎn)量性狀產(chǎn)生了不同程度的影響(表2)。與野生型植株(WT)相比，轉(zhuǎn)基因株系L8和L12葉片鮮質(zhì)量分別增加98.43%和76.89%；葉片干質(zhì)量分別增加62.79%和41.86%；果實(shí)單果質(zhì)量分別增加49.65%和36.13%；單株產(chǎn)量分別增加34.50%和26.74%，而莖的干鮮質(zhì)量和單株果數(shù)無(wú)明顯差異。

圖C中a和b表示各處理間差異顯著(P<0.05) a and b mean significant difference(P<0.05) in Duncan’s in figure C

A.SlSP5G3過(guò)表達(dá)植株L8和野生型植株的開花對(duì)比圖 Flowering comparison ofSlSP5G3over-expressing strain L8 and wild type plants；B.SlSP5G3過(guò)表達(dá)植株L12和野生型植株的開花對(duì)比圖 Flowering comparison ofSlSP5G3over-expressing strain L12 and wild type plants；C.SlSP5G3過(guò)表達(dá)植株和野生型植株的開花所需葉片數(shù) Number of leaves to flowering ofSlSP5G3over-expressing plants and wild type plants

圖4SlSP5G3過(guò)表達(dá)植株和野生型株的開花時(shí)間
Fig.4FloweringtimeofSlSP5G3over-expressingplantsandwildtypeplants

A.SlSP5G3過(guò)表達(dá)植株和野生型植株對(duì)SlCDFs表達(dá)量的影響 Effects ofSlSP5G3over-expressing plants and wild type plants on the expression ofSlCDFs；B.SlSP5G3過(guò)表達(dá)植株和野生型植株對(duì)TCOLs表達(dá)量的影響 Effects ofSlSP5G3over-expressing plants and wild type plants on the expression ofTCOLs

圖5 SlSP5G3過(guò)表達(dá)植株和野生型植株中SlCDFs和TCOLs的表達(dá)量Fig.5 The expression of SlCDFs and TCOLs in SlSP5G3 over-expressing plants and wild type plants

注：數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Data in the table are presented as “mean±standard deviation”,the different lowercase letters in the same column indicates significant difference(P<0.05).

3 討 論

葉片是植物感受光周期的主要部位，光敏色素作為葉片中感受光信號(hào)的最初受體與擬南芥FT基因表達(dá)的相互作用已經(jīng)被證明[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)SlSP5G3能夠感受光信號(hào)，在光照開始后4 h上升至最高，在進(jìn)入黑暗后4 h下降至最低，可能是由于光敏色素傳遞了光信號(hào)，但其與SlSP5G3的作用關(guān)系還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。SlSP5G3在葉片和子葉中的表達(dá)量最高，其他組織基本不表達(dá)，且不受發(fā)育時(shí)期的影響，這與煙草FT-like基因表達(dá)一致[7]。

FT-like蛋白的功能很大程度是由其氨基酸序列決定的，曹凱[23]通過(guò)蛋白質(zhì)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在番茄SlSP3D蛋白的3個(gè)關(guān)鍵位置的氨基酸殘基分別為酪氨酸(133)、甘氨酸(136)和色氨酸(137)與其他的開花活化因子相匹配，如擬南芥中的FT蛋白、甜菜的BvFT2蛋白和煙草的NtFT4蛋白。而番茄SlSP5G的氨基酸序列的這3個(gè)保守位點(diǎn)與大多數(shù)開花抑制因子是一樣的，如煙草中FT蛋白NtFT1、NtFT2、NtFT3。番茄SlSP5G2蛋白和SlSP5G3蛋白在相應(yīng)位點(diǎn)與其他番茄FT-like蛋白相比都發(fā)生了一定改變。本試驗(yàn)通過(guò)培育轉(zhuǎn)基因‘Micro-Tom’發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SlSP5G3可以延遲開花，與對(duì)照相比平均晚開花 2～3 片葉，可能是由于保守位點(diǎn)的基因突變將其功能轉(zhuǎn)變?yōu)橐种崎_花。擬南芥CDF和COL蛋白是調(diào)控FT基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，番茄存在與擬南芥CDF和COL高度同源的蛋白分別是SlCDF1、SlCDF2、SlCDF3、SlCDF4、SlCDF5、TCOL1、TCOL2和TCOL3。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SlSP5G3過(guò)表達(dá)植株中，3個(gè)TCOLs基因和4個(gè)SlCDFs基因表達(dá)量并無(wú)明顯變化，但對(duì)SlCDF3有顯著的促進(jìn)作用，相比于野生型植株表達(dá)量上升5～10倍。筆者推測(cè)SlSP5G3基因編碼的FT-like蛋白通過(guò)篩管細(xì)胞到達(dá)頂端分生組織與下游轉(zhuǎn)錄因子FD結(jié)合之后，反饋調(diào)節(jié)上游SlCDF3基因的表達(dá)，具體的作用關(guān)系還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

開花時(shí)間的早晚受外界因素調(diào)控并直接影響植株的產(chǎn)量。如在大豆中，花期的早晚與結(jié)莢率之間呈顯著的相關(guān)性，且大豆產(chǎn)量取決于接莢的花數(shù)[24]。低緯度地區(qū)種植的大豆明顯表現(xiàn)出植株矮小，開花成熟期提前，產(chǎn)量降低。趙薇等[25]研究發(fā)現(xiàn)不同春化處理對(duì)蠶豆開花和產(chǎn)量產(chǎn)生重要影響，首花時(shí)間、鮮莢始收時(shí)間最早的蠶豆單株產(chǎn)量最高。赤霉素處理的西紅花開花時(shí)間提前，導(dǎo)致開花數(shù)量和花絲產(chǎn)量明顯增加[26]。FT-like基因編碼的成花素是控制植物開花時(shí)間的重要因子，可以通過(guò)改變其表達(dá)量進(jìn)一步調(diào)控產(chǎn)量。在番茄sft突變體中，沒有形成完整的多花序結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致sft突變體植株變大且伴隨著極少的花序、花和果實(shí)[27]。番茄SP基因調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換。sp突變體植株形成較短的合軸分枝，直到出現(xiàn)2個(gè)連續(xù)的花序后停止生長(zhǎng)[28]，與sp突變體植株相比，sp5gsp突變體開花期提前，收獲指數(shù)上升[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SlSP5G3基因過(guò)表達(dá)植株通過(guò)延遲開花時(shí)間提升了葉片干鮮質(zhì)量，單果質(zhì)量和單株產(chǎn)量，與同源基因SlSP5G在控制產(chǎn)量方面存在類似的功能。延遲開花使植物積累更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，推遲從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。葉片中積累了更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提升了地上部生物量。同時(shí)建立新的源庫(kù)關(guān)系模式，提升總產(chǎn)量，為轉(zhuǎn)基因育種提供新思路。

4 結(jié) 論

SlSP5G3受光環(huán)境調(diào)控，在真葉和子葉中主要表達(dá)，且表達(dá)量不受生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的影響；SlSP5G3作為開花抑制因子增加‘Micro-Tom’的開花所需葉片數(shù)，延遲開花時(shí)間；SlSP5G3促進(jìn)上游SlCDF3基因的過(guò)量表達(dá)，提升‘Micro-Tom’番茄的地上部生物量積累、單果質(zhì)量和單株產(chǎn)量。