杜雪玲 ，馬媛媛，程洋洋，何 軍，宋運(yùn)賢， 余如剛

(1.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000；2.北京陽光綠地生態(tài)科技有限公司，北京 100083)

蘿卜(RaphanussativusL.)屬十字花科蘿卜屬，1 a、2 a生草本植物。肉質(zhì)直根為蘿卜主要貯藏和食用器官，它的形成與產(chǎn)量和品質(zhì)緊密相關(guān)[1-2]。肉質(zhì)直根的形狀和大小在蘿卜品種間存在基因型差異，直徑為1～30 cm，長度為3～2 m[3]。通常育種家通過選育不同根大小的蘿卜滿足消費(fèi)者的需求。因此，揭示蘿卜肉質(zhì)直根膨大形成的分子調(diào)控機(jī)制非常重要。

目前，對蘿卜肉質(zhì)直根的形態(tài)和解剖學(xué)已有深入的研究，發(fā)現(xiàn)蘿卜肉質(zhì)直根的增粗是由維管束形成層的活動產(chǎn)生次生木質(zhì)部(主要)和韌皮部，以及薄壁細(xì)胞分裂和膨大而形成[1,4]。另據(jù)蘿卜肉質(zhì)直根形成膨大的生理生化研究表明，肉質(zhì)直根的膨大還受到激素和環(huán)境因子的影響[5-6]。植物生長發(fā)育期間，器官的形成是基于基因持續(xù)表達(dá)及其組織或發(fā)育時期的特異性基因表達(dá)的結(jié)果。然而，有關(guān)決定蘿卜肉質(zhì)直根大小的關(guān)鍵基因分離及其形成的分子機(jī)制尚鮮有報道。

近年來，隨著組學(xué)測序技術(shù)的發(fā)展，基于新一代高通量測序平臺的數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital gene expression profiling， DGE)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物貯藏根生長發(fā)育過程中的基因差異表達(dá)分析，如胡蘿卜[7]、蕪菁[8]、蓮藕[9]和甘薯[10]等，闡明了植物貯藏根生長發(fā)育的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。Yu等[11]運(yùn)用基于高通量測序的DGE技術(shù)，對蘿卜‘NAU-YH’不同發(fā)育時期(破肚前期、破肚期和膨大期)的肉質(zhì)直根進(jìn)行測序，并獲得大量的差異表達(dá)基因及其功能注釋和富集調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。蘿卜全基因組序列已被日本學(xué)者公布[12]，基于此序列，Xu等[13]利用高通量測序技術(shù)對長形蘿卜不同發(fā)育時期(7、14、20、60、90 d)的根和葉進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。盡管高通量測序技術(shù)已成功鑒定到參與肉質(zhì)直根生長發(fā)育的大量候選基因，但利用DGE技術(shù)對不同基因型間蘿卜肉質(zhì)直根直徑大小的差異表達(dá)基因研究鮮有報道。本研究以公開的蘿卜基因組為參考序列，利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，對2種根直徑大小不同的圓球形蘿卜 ‘揚(yáng)州圓白’(直徑大)和‘薩丁’(直徑小)在破肚期和膨大期的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。利用生物信息學(xué)手段，對差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋和功能分類。以期洞察調(diào)控蘿卜肉質(zhì)根大小的分子機(jī)制，為進(jìn)一步基因功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)及處理

以圓球形蘿卜‘揚(yáng)州圓白’(肉質(zhì)根直徑10 cm左右，YB)和‘薩丁’(肉質(zhì)根直徑2～3 cm， SD)為材料，挑取整齊飽滿基本一致的種子，經(jīng)過φ=1%次氯酸鈉溶液消毒，于25 ℃黑暗培養(yǎng)，萌發(fā)后于營養(yǎng)缽中培養(yǎng)，溫度：白天25 ℃/夜晚18 ℃，光照16 h。播種后1周間苗，每盆留3株苗，每個品種6盆。分別采集培養(yǎng)時間為播后 20 d(破肚期)和播后40 d(膨大期)的蘿卜肉質(zhì)直根材料。取樣后，將每盆中根樣品(3株/盆)用蒸餾水洗滌，等量混合在一起、切碎，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測 分別將YB和SD蘿卜肉質(zhì)直根2個不同發(fā)育時期(播后20 d和40 d)的根樣品等量混合，然后采用Trizol試劑盒(Invitrogen,USA)分別提取YB和SD混合根樣品的總RNA，操作步驟參照試劑盒提供的說明書進(jìn)行。利用Nanodrop檢測RNA的純度(OD260/OD280≥1.8)，采用Agilent 2100檢測RNA的完整性。

1.2.2 DGE文庫構(gòu)建和Illumina測序 DGE文庫構(gòu)建和數(shù)字基因表達(dá)譜測序是在北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行(Novogene,Beijing,China)。將提取的YB和SD蘿卜的肉質(zhì)根總RNA，分別用于構(gòu)建2個DGE文庫(YB和SD庫)。其步驟如下，利用帶有Oligo(dT)的磁珠，通過A-T互補(bǔ)配對與mRNA的ployA尾結(jié)合的方式富集純化mRNA，并加入緩沖液，將其打斷成短片段，再以片段化后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA；合成的雙鏈cDNA經(jīng)末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，接著用AMPure XP 體系進(jìn)行片段大小選擇，然后進(jìn)行PCR富集得到最終的DGE文庫；構(gòu)建好的文庫使用Agilent 2100 system進(jìn)行質(zhì)量檢測，合格后進(jìn)行Illumina HiSeq測序(參照諾禾致源測序結(jié)題報告)。

1.2.3 差異表達(dá)基因篩選 為了提高篩選蘿卜根大小品種間差異關(guān)鍵基因的準(zhǔn)確性，本研究差異表達(dá)基因篩選方法參照Pimentel等[14]，結(jié)合基于泊松分布的DEGseq和基于貝葉斯推斷法的Cuffdiff2兩種方法進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析。其中，DEGSeq采用TMM(Trimmed mean of M-values，M-值的加權(quán)截尾均值)對基因序列數(shù)(read count)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以設(shè)定閾值錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)q-value <0.005和 |log2fold change|≥ 1(fold change為差異倍數(shù))作為基因差異表達(dá)的評判標(biāo)準(zhǔn)；而Cuffdiff2軟件采用FPKM(Expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced，每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數(shù)目)對read count數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以q-value < 0.05和 |log2fold change| ≥ 1作為基因差異表達(dá)的評判標(biāo)準(zhǔn)。最后，取2種方法獲得的差異表達(dá)基因交集作為本研究進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 RT-qPCR分析 利用Trizol試劑盒(Invitrogen,USA)，在YB和SD中，分別提取肉質(zhì)直根2個不同發(fā)育時期(播后20 d和40 d)的總RNA，命名為YB20、YB40、SD20和SD40。然后使用PrimeScript○RRT 試劑盒 (Takara,Dalian,China)將各時期的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。從鑒定的差異表達(dá)基因中選擇6個與細(xì)胞壁代謝酶相關(guān)的候選基因進(jìn)行RT-qPCR分析。利用Beacon Designer 7.0軟件對基因的特異引物進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)。RT-qPCR反應(yīng)在實(shí)時熒光定量PCR儀(ABC7300)中進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)[15]。每個樣品有3次生物學(xué)重復(fù)(將每盆3株苗的根樣品等量混合形成1個生物學(xué)重復(fù))，且每個生物學(xué)重復(fù)有3次技術(shù)重復(fù)；以β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，按照 2-ΔΔCT法計(jì)算特異基因相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2010計(jì)算每個基因在生物學(xué)重復(fù)中的標(biāo)準(zhǔn)差，對同一個基因在2個品種肉質(zhì)根不同發(fā)育時期的結(jié)果做t檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序概況及其參考序列比對結(jié)果分析

以YB和SD破肚期和膨大期的肉質(zhì)根為材料構(gòu)架2個數(shù)字基因表達(dá)文庫，分別獲得YB和SD原始序列總數(shù)分別為9 971 691 個和11 089 789個，經(jīng)去除接頭污染、N(無法確定堿基信息)含量超過10%和低質(zhì)量序列，YB和SD各庫凈序列總數(shù)分別獲得9 930 954個和11 036 869個(表2)。

表1 用于RT-qPCR分析的引物Table 1 Primers used for RT-qPCR analysis

將獲得的凈序列總數(shù)與參考基因組比對分析，發(fā)現(xiàn)2個DGE文庫當(dāng)中有80%(YB：8 550 057，86.10%；SD：8 933 608，80.94%)以上的凈序列總數(shù)能夠成功定位到參考基因組上，說明參考基因組選擇合適，而且相關(guān)試驗(yàn)不存在污染(表3)。同時，發(fā)現(xiàn)YB和SD文庫中，比對到基因組上的序列數(shù)分別有8 172 997和8 509 539個為唯一匹配，這些序列數(shù)將被用于差異表達(dá)基因的篩選(表3)。

2.2 差異表達(dá)基因篩選

利用DEGseq在YB和SD文庫中共獲得3 666個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，Cuffdiff2共獲得1 924個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。求交集，共篩選出1 468個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，其中有1 369個轉(zhuǎn)錄本在YB和SD中共同表達(dá)，占所有差異表達(dá)基因的93.3%。另外，有48和51個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分別在YB和SD中特異性表達(dá)，分別占所有差異表達(dá)基因的3.3%和3.5%(圖1)。

2.2.1 參與細(xì)胞壁代謝的差異表達(dá)基因鑒定 植物細(xì)胞的生長與細(xì)胞壁伸展性密切相關(guān)[16]。本研究共鑒定到28個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本編碼的關(guān)鍵酶參與細(xì)胞壁代謝(表4)。其中，編碼細(xì)胞壁降解酶有20個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，相比SD，大多數(shù)編碼細(xì)胞壁降解酶的轉(zhuǎn)錄本在YB中上調(diào)表達(dá)，如內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase,EG,2/2)、多聚半乳糖醛酸酶抑制劑(Polygalacturonase inhibitor,PGIP,4/5)、果膠酯酶/果膠酯酶抑制劑(Pectinesterase/pectinesterase inhibitor,PMEI,2/4)、果膠(甲)酯酶(pectinesterase,PE,1/1)和木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶(xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase,XTH,5/5)；多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG,)在YB中有1個差異轉(zhuǎn)錄本上調(diào)和2個下調(diào)表達(dá)。令人驚奇的是，纖維素酶(cellulase)在SD和YB比較中沒有差異表達(dá)。另外，YB與SD比較中，編碼細(xì)胞壁合成酶有3個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，包括1個編碼木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶4(Xyloglucan glycosyltransferase 4,CSLC4)和2個編碼纖維素合成酶類似蛋白(Cellulose synthase-like protein,CSLD2和CSLD3)的轉(zhuǎn)錄本，在YB中均上調(diào)表達(dá)(表4)。

表2 原始數(shù)據(jù)產(chǎn)出組成Table 2 The component of sequencing raw data in YB and SD

表3 測序序列與蘿卜基因組比對結(jié)果Table 3 The blast result of the reads with radish genome

圖1 YB和SD品種間差異表達(dá)基因維恩圖Fig.1 The Venn of differential expression genes (DEGs) between YB and SD

此外，還發(fā)現(xiàn)了2個參與細(xì)胞壁代謝調(diào)控的關(guān)鍵因子，糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(COBRA,COB)和擴(kuò)展蛋白(expansin,EXP)在YB與SD比較中差異表達(dá)。與SD相比較，大多數(shù)編碼EXP蛋白(3/4)和COB蛋白(1/1)的差異轉(zhuǎn)錄本在YB中上調(diào)表達(dá)(表4)。

2.2.2 參與蔗糖代謝的差異表達(dá)基因鑒定 肉質(zhì)直根是蘿卜碳水化合物和蛋白質(zhì)的貯藏庫，參與蔗糖代謝的酶在肉質(zhì)根的形成過程中發(fā)揮了重要的作用[17]。本研究共鑒定到編碼參與蔗糖代謝途徑的2個相關(guān)酶的2個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(表5)。YB與SD比較中，一個編碼催化己糖磷酸化的己糖激酶(hexokinase 3,HK3)的轉(zhuǎn)錄本在YB中上調(diào)表達(dá)；一個編碼蔗糖分解代謝中轉(zhuǎn)化酶(beta-fructofuranosidase,AtBETAFRUCT)的轉(zhuǎn)錄本在YB中下調(diào)表達(dá)(表5)。此外，基于Cuffdiff2法，編碼蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)和蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SuSy)的轉(zhuǎn)錄本在YB和SD比較中沒有差異表達(dá)。

2.2.3 參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑差異表達(dá)基因鑒定 植物激素信號對根的發(fā)育起關(guān)鍵作用[18]。本研究共鑒定到激素相關(guān)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本29個，其中有4個、1個、1個、4個、1個、4個、13個和1個分別參與到生長素(auxin)、細(xì)胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)、乙烯(ETH)、油菜素類固醇(BR)、茉莉酸(TA)和水楊酸(SA)的生物合成、代謝、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等各個過程(表6)。這些差異轉(zhuǎn)錄本被分別匹配到SAUR、A-ARR、DELLA、PYR/PYL、PP2C、ABF、ERF2、TCH4、CYCD3、JAZ和NPR1等植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的基因家族(表6)。YB與SD比較中，SAUR家族匹配上的不同差異轉(zhuǎn)錄本表達(dá)不一致，在YB中即有上調(diào)表達(dá)又有下調(diào)表達(dá)；A-ARR、ERF2、TCH4、CYCD3和JAZ家族匹配上的不同差異轉(zhuǎn)錄本在YB中都上調(diào)表達(dá)。DELLA、PYR/PYL、PP2C、JAR1、ABF和NPR1家族匹配上的不同差異轉(zhuǎn)錄本在YB中都下調(diào)表達(dá)。另外，細(xì)胞分裂素、油菜素類固醇和茉莉酸相關(guān)的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，在YB中整體上調(diào)表達(dá)。相反，生長素、赤霉素、脫落酸和水楊酸在YB中整體下調(diào)表達(dá)。

表4 YB 和SD中參與細(xì)胞壁代謝的候選差異表達(dá)基因Table 4 Candidate DEGs involved in cell wall metabolism in YB and SD

表5 YB 和SD中參與蔗糖代謝的候選差異表達(dá)基因Table 5 Candidate DEGs involved in sucrose metabolism in YB and SD

表6 YB 和SD中參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑候選差異表達(dá)基因Table 6 Candidate DEGs involved in pathway of plant hormone signal transduction in YB and SD

2.3 RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證數(shù)字基因表達(dá)譜測序的可靠性和有效性，選取6個與細(xì)胞壁代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證(圖2)。結(jié)果表明，6個差異表達(dá)基因在YB和SD蘿卜肉質(zhì)直根2個不同發(fā)育時期(播后20 d和40 d)具有明顯的差異表達(dá)。其中，6 個差異基因在RT-qPCR驗(yàn)證表達(dá)模式與DGE測序所得結(jié)果基本相符。例如，PG和PMEI3在SD中的相對表達(dá)水平高于YB，且PG在SD的破肚期表達(dá)水平高于膨大期，相反，PMEI3在SD和YB中的膨大期較高。此外，CSLD3、EG17、XTH22和PGIP1在YB中的表達(dá)水平高于SD。這些結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)基于RNA-Seq的數(shù)字基因表達(dá)譜測序的可靠性和有效性。

不同字母代表在P<0.05 水平顯著性差異 Different letters indicate significant differences atP<0.05

圖26個候選差異表達(dá)基因在YB和SD中不同根發(fā)育時期的RT-qPCR分析
Fig.2RT-qPCRanalysisofsixcandidateDEGswithdifferentdevelopmentstagesofrootsinYBandSD

3 討 論

不同的蘿卜品種中，肉質(zhì)直根的大小和形狀存在很大的差異。其形狀和大小是影響運(yùn)輸效率、加工效率和消費(fèi)的重要因素。由此，形狀和大小不僅直接決定蘿卜的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且也關(guān)系到產(chǎn)品的價格。因此，揭示不同蘿卜肉質(zhì)直根形狀和大小形成的生理和分子機(jī)制具有重要意義。目前，有關(guān)蘿卜肉質(zhì)直根形狀和大小形成的生理機(jī)制已有報道[4,19]。然而，有關(guān)決定蘿卜及其他根菜類作物根大小和形狀形成的關(guān)鍵分子機(jī)制知之甚少[20]。鑒于此，本研究利用DGE技術(shù)，對2種不同根直徑大小的圓球形蘿卜：‘揚(yáng)州圓白’和‘薩丁’進(jìn)行DGE文庫構(gòu)建以及測序分析，通過2種方法篩選求交集，共獲得1 468個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。有1 369個(93.3%)轉(zhuǎn)錄本在YB和SD中共同表達(dá)，暗示這些基因在蘿卜品種間根發(fā)育過程中具有功能保守性；另外，有48個(3.3%)和51個(3.5%)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分別在YB和SD中特異性表達(dá)(圖1)，暗示這些基因可能是引起2個品種根直徑大小差異的調(diào)控因素，這些結(jié)果為揭示蘿卜肉質(zhì)根大小和形狀形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞壁的力學(xué)特性通過調(diào)控細(xì)胞的擴(kuò)張性來控制細(xì)胞的大小和形狀，從而決定組織和器官的形態(tài)[21]。蘿卜肉質(zhì)直根的形成主要是次生木質(zhì)部和次生韌皮部薄壁細(xì)胞生長的結(jié)果[1]。目前，已有研究證實(shí)幾個細(xì)胞壁代謝相關(guān)的基因，如EXP[22]、COB[23]、XTH[24]通過影響細(xì)胞壁軟化從而促進(jìn)細(xì)胞體積的增大。本研究共鑒定出28個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本與細(xì)胞壁代謝相關(guān)。其中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)編碼EXP(3/4)、COB(1/1)、XTH(5/5)的轉(zhuǎn)錄本在YB中上調(diào)表達(dá)。暗示這3個基因可能是‘揚(yáng)州圓白’和‘薩丁’蘿卜肉質(zhì)直根直徑大小差異的影響因子。

蔗糖和己糖是植物中調(diào)節(jié)“庫-源”關(guān)系的重要信號分子。蘿卜肉質(zhì)直根為主要的庫器官。蔗糖作為光合作用的主要產(chǎn)物，為肉質(zhì)直根的形成提供生長代謝原料[25]。與蔗糖代謝和積累緊密相關(guān)的酶主要有蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SuSy)和蔗糖轉(zhuǎn)化酶(INV)。有關(guān)蔗糖代謝對蘿卜肉質(zhì)直根形成的影響已有相關(guān)報道[26-27]。通過對不同根冠比蘿卜研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜庫的活性與SuSy基因密切相關(guān)，而不是INV[27-28]。由此推測SuSy可能是調(diào)節(jié)肉質(zhì)根蔗糖水平、控制肉質(zhì)根庫活性的關(guān)鍵酶。但是，基于KEGG途徑分析，本研究僅篩選出1個參與蔗糖代謝的酶家族的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，即轉(zhuǎn)化酶基因ATBETAFRUCT4(Rsa1.0_00018.1_g00046.1)在YB中下調(diào)表達(dá)，暗示ATBETAFRUCT4可能參與‘揚(yáng)州圓白’和‘薩丁’蘿卜肉質(zhì)直根直徑大小差異的調(diào)控。相反，SuSy和SPS基因在YB和SD比較中沒有變化。對于這些基因是否參與蘿卜肉質(zhì)直根直徑大小差異的調(diào)控還需進(jìn)一步功能驗(yàn)證。

另外，據(jù)報道，光合同化產(chǎn)物的分配，除了蔗糖外，其分解產(chǎn)物己糖通過糖酵解途徑為植物的生理活動也提供各種養(yǎng)分[25]。植物體內(nèi)己糖必需經(jīng)磷酸化后才能進(jìn)入糖酵解途徑，己糖激酶是催化己糖磷酸化的酶系統(tǒng)。研究表明木薯的塊根形成過程中，膨大期己糖激酶的活性最高，而塊根成熟期，己糖激酶的活性有所降低[29]；此外，MeHK2基因在木薯塊根形成期表達(dá)量最高，表明該基因在塊根膨大過程中起一定的作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)一個編碼HK3基因的轉(zhuǎn)錄本(Rsa1.0_08050.1_g00001.1)在YB中上調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明，HK3基因可能是影響‘揚(yáng)州圓白’和‘薩丁’蘿卜肉質(zhì)直根直徑大小差異的因子。

植物激素對貯藏根的發(fā)育和膨大具有重要作用[18,29]。本研究共鑒定到激素相關(guān)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本29個，分別參與了生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素類固醇、茉莉酸和水楊酸等8條植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。生長素具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化以及細(xì)胞膨大的作用[30]，本研究發(fā)現(xiàn)參與生長素代謝途徑的4個差異轉(zhuǎn)錄本均為SAUR基因，2個SAUR差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(Rsa1.0_01909.1_g00006.1和Rsa1.0_00483.1_g00001.1)在YB中上調(diào)表達(dá)，2個(Rsa1.0_00019.1_g00012.1和Rsa1.0_00269.1_g00025.1)在YB中下調(diào)表達(dá)，暗示同一個SAUR基因家族不同成員在蘿卜肉質(zhì)根膨大過程中所起的作用不同。CTK誘導(dǎo)貯藏根形成時的細(xì)胞分裂，促進(jìn)分生組織的擴(kuò)大[31]，A-type ARR在抑制細(xì)胞分裂素反應(yīng)中起重要作用[32]。筆者發(fā)現(xiàn)1個參與CTK代謝途徑的A-ARR基因(Rsa1.0_05100.1_g00001.1)在YB中均上調(diào)表達(dá)，暗示了A-ARR基因不是引起2個蘿卜根直徑大小差異的主要因子，其具體功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。JA通過促進(jìn)碳水化合物代謝而引起貯藏根的形成[33]。TIFY家族中的JAZ亞家族蛋白是JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控因子，可以啟動JA應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄[34]。擬南芥中，過表達(dá)ZIM/AtTIFY1基因促進(jìn)葉柄和下胚軸伸長[35]。本研究發(fā)現(xiàn)12個編碼TIFY蛋白的差異轉(zhuǎn)錄本，屬于JAZ亞家族基因，在YB中均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。其中，TIFY10B(Rsal.001963.1_g00004.1)在YB中特異性表達(dá)，暗示這個基因可能是‘揚(yáng)州圓白’蘿卜肉質(zhì)直根的膨大關(guān)鍵因子。GA能夠調(diào)控根細(xì)胞的膨大[36]，本研究發(fā)現(xiàn)GA信號通路中的負(fù)向調(diào)控因子DELLA蛋白在YB中下調(diào)表達(dá)。ETH刺激細(xì)胞延伸從而引起貯藏根膨大[37]，ERF與EREBPs可以與靶基因啟動子上的GCCbox相互作用，從而激活ETH響應(yīng)[38]。本研究發(fā)現(xiàn)1個ERF2基因在YB中均上調(diào)表達(dá)。BR提高蘿卜可溶性蛋白質(zhì)含量[39],也可以促進(jìn)植物的生長和細(xì)胞的膨大，CYCD3是BR響應(yīng)的下游組件，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂[40]。本研究發(fā)現(xiàn)1個CYCD3基因在YB中表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達(dá)；此外，據(jù)報道在擬南芥中BR通過增加AtXTH22基因(TCH4)表達(dá)量促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)展伸長[41]。本研究發(fā)現(xiàn)3個編碼XTH22酶基因在YB中均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果推測，TIFYs、DELLA、ERF2、XTH22和CYCD3基因可能是引起YB和SD根直徑大小差異的調(diào)控因子。以上所有基因在蘿卜肉質(zhì)根發(fā)育過程中的生理作用尚需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

基于RNA-seq測序的數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，本研究共獲得1 468個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。功能注釋共鑒定28個差異轉(zhuǎn)錄本參與細(xì)胞壁代謝，2個差異轉(zhuǎn)錄本參與蔗糖代謝，29個差異轉(zhuǎn)錄本參與激素合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。令人感興趣的是，一些參與植物激素合成與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(TIFYs、DELLA、ERF2和CYCD3)、蔗糖代謝相關(guān)基因(ATBETAFRUCT4和HK3)和細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因(XTHs、EXPs和COBs)在‘揚(yáng)州圓白’蘿卜中上調(diào)表達(dá)，推測這些基因可能參與‘揚(yáng)州圓白’和‘薩丁’蘿卜肉質(zhì)直根大小的差異的調(diào)控。同時利用RT-qPCR 對6個細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了驗(yàn)證。這些結(jié)果將有助于對控制根大小相關(guān)基因的進(jìn)一步功能分析，并為揭示蘿卜肉質(zhì)直根大小基因型間差異的分子機(jī)制提供依據(jù)。