楊大鵬，葛聞博，何玉琴，張全偉，王 霞，周凱仁，陳衛(wèi)剛，包瑩瑩

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

褪黑素 (Melatonin , MT)主要系哺乳動(dòng)物松果體分泌的一種具有廣泛生理作用的吲哚類物質(zhì)，其體內(nèi)合成是由前體物質(zhì)色氨酸在一系列脫羧酶和甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下最終轉(zhuǎn)化為N-乙酰基-5-甲氧基色胺即褪黑素[1]。MT在雌性動(dòng)物卵泡發(fā)育、排卵、妊娠及激素分泌等過程發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用[2]。褪黑激素受體(Melatonin receptor，MTR)是 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員，有 7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的多肽[3]。已有研究表明，褪黑素通過與褪黑激素受體結(jié)合而發(fā)生作用,對調(diào)控動(dòng)物季節(jié)性發(fā)情等生殖生理活動(dòng)具有重要作用[4]。MTR 受體分為 MTR1 和 MTR2，MTR1有MTR1a、MTR1b和MTR1c 3種亞型[5]。MTR1a多分布于哺乳動(dòng)物下丘腦的視交叉神經(jīng)上核(Suprachi-asmtic nucleus,SCN)及垂體結(jié)節(jié)部,參與動(dòng)物生殖調(diào)控[6]。但MTR1a基因的表達(dá)是否與雌性動(dòng)物發(fā)情周期輸卵管和子宮等功能活動(dòng)有關(guān)尚未見報(bào)道。

高原甘加型藏綿羊是典型的季節(jié)性發(fā)情哺乳動(dòng)物，生活在高原高海拔天然牧區(qū)，具有抗高寒、抗逆以及遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)良種質(zhì)特性，是中國寶貴的畜牧資源。高原甘加型藏綿羊一般在 2.5 歲開始配種，發(fā)情周期平均為 16 d±2 d，每年產(chǎn)羔 1 次，每胎 1 羔，繁殖率較低，極大地影響藏區(qū)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展[7-8]。因此,研究發(fā)情周期內(nèi)甘加型藏綿羊生殖生理特點(diǎn)及變化規(guī)律，對草地畜牧業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義。有關(guān)甘加型藏綿羊生殖周期MTR1a基因在輸卵管和子宮組織中表達(dá)規(guī)律的研究尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測MTR1amRNA在甘加型藏綿羊發(fā)情周期輸卵管和子宮組織內(nèi)的表達(dá)規(guī)律，為從分子水平研究甘加型藏綿羊生殖活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)數(shù)據(jù)，并為探討甘加型藏綿羊生殖激素變化規(guī)律和季節(jié)性繁殖之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于甘加型藏綿羊繁殖季節(jié)(7-9月)，在甘肅省甘南藏族自治州夏河縣甘加鄉(xiāng)海拔3 600 m以上的藏綿羊養(yǎng)殖合作社隨機(jī)選取2.5～3.5歲雌性健康空懷的甘加型藏綿羊32只，分為發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期 4 組，每組8 只，跟蹤觀察2個(gè)生殖周期，根據(jù)公羊爬跨結(jié)合陰道脫落細(xì)胞圖片法判斷發(fā)情狀況后開始取樣。采用頸部局部麻醉頸動(dòng)脈放血法無痛處死試驗(yàn)羊，快速取出輸卵管和子宮，置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，超低溫冰箱凍存，備用。

1.2 主要試劑及儀器

熒光定量試劑盒、TransZol up Plas RNA Kit、gDNA Remover、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 DEPC、 氯仿、Trans DNA marker等購自北京全式金生物有限公司；7300型qRT-PCR儀購自上海普迪生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)JY04S-3C購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；RNA檢測儀為超微量核酸蛋白測定儀，購自上海在途生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上的綿羊MTR1a和β-actin基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物科技有限公司合成(表1)。

表1 MTR1a 和β-actin基因引物序列Table 1 Primers sequences of MTR1a and β-actin gene

1.4 總RNA的提取與cDNA的合成

試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照TransZol up RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。為提高RNA的純度，用氯仿抽提1次。采用超微量核酸蛋白測定儀測定RNA質(zhì)量，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。嚴(yán)格按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA鏈的合成，反應(yīng)體系為20 μL，合成的cDNA鏈保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，qRT-PCR反應(yīng)總體系為20 μL，其中包括模板1 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，Passive Reference Dye(50×)(optional) 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL。每個(gè)樣品重復(fù) 3 次。擴(kuò)增環(huán)境條件為 94 ℃ 預(yù)變性 30 s；94 ℃ 變性 5 s，60 ℃退火 15 s,72 ℃延伸 10 s，循環(huán)45次

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，t檢驗(yàn)比較其差異顯著性，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取

提取的總RNA用超微量核酸蛋白測定儀檢測光密度比值D260/D280，結(jié)果顯示均為1.8～2.0。分別取輸卵管和子宮的總RNA 5 μL用瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，可見有28S、18S和5S 3 條清晰的條帶，表明提取產(chǎn)物合格，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

A.輸卵管 Oviduct；B.卵巢 Uterus

2.2 甘加型藏綿羊發(fā)情周期內(nèi)輸卵管和子宮組織中 MTR1a mRNA的表達(dá)量

在甘加型藏綿羊發(fā)情周期不同階段，輸卵管和子宮組織中均有MTR1amRNA表達(dá)(表2)。輸卵管中間情期MTR1amRNA的相對表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)時(shí)期(P<0.05)；子宮中發(fā)情后期的相對表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)時(shí)期(P<0.01)。

表2 MTR1a mRNA在輸卵管和子宮組織中的相對表達(dá)量 Table 2 The relative expression level of MTR1a mRNA in the oviduct and uterus

注：同行不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different capital letters in the same row indicate that the difference is extremely significant(P<0.01)，different lowercase letters indicate difference(P<0.05).

3 討 論

3.1 甘加型藏綿羊發(fā)情周期內(nèi) MTR1a mRNA在輸卵管中的表達(dá)變化規(guī)律

目前，已有大量研究表明褪黑素(MT)參與動(dòng)物生殖調(diào)控。李伶俐等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MT在雌性大鼠下丘腦可抑制GnRH 的合成和釋放，從而降低垂體對 GnRH 的反應(yīng)性，抑制雌性大鼠 HPG 軸功能的提前啟動(dòng)。孫永明等[3]研究發(fā)現(xiàn)，MT可作用于內(nèi)蒙古絨山羊下丘腦和垂體來分別抑制促性腺激素釋放激素和促性腺激素的釋放，從而影響其生殖調(diào)控。MT可通過MTR抑制垂體結(jié)節(jié)部催乳素(PRL)的分泌，而PRL可通過Kisspeptins/GPR54神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)影響GnRH和FSH等多種生殖激素的分泌[10]。此類生殖激素通過血液循環(huán)進(jìn)入動(dòng)物生殖腺影響動(dòng)物生殖生理，而MT也可通過血液循環(huán)直接進(jìn)入到動(dòng)物輸卵管組織，與輸卵管上MTR結(jié)合發(fā)揮作用。王麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，沂蒙黑山羊發(fā)情周期內(nèi)輸卵管組織中有促性腺激素受體(GnRHR)基因的表達(dá)。而有關(guān)MTR1amRNA在羊輸卵管組織中表達(dá)的研究鮮見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，甘加型藏綿羊發(fā)情周期內(nèi)各個(gè)時(shí)期MTR1amRNA在輸卵管組織中均有表達(dá)，且在各個(gè)時(shí)期的表達(dá)存在差異，在間情期和發(fā)情前期表達(dá)量相對較高，發(fā)情期和發(fā)情后期表達(dá)量相對較低，說明MTR1amRNA在輸卵管表達(dá)水平的變化對甘加型藏綿羊的發(fā)情和輸卵管生殖活動(dòng)具有一定影響。MTR1amRNA在輸卵管的表達(dá)水平反映MT與輸卵管上MTR1a受體的結(jié)合水平，表明MT對甘加型藏綿羊輸卵管的生殖活動(dòng)有調(diào)控作用。

3.2 甘加型藏綿羊發(fā)情周期內(nèi) MTR1a mRNA在子宮中的表達(dá)變化規(guī)律

有研究發(fā)現(xiàn)，MT在歐洲野牛生殖期對其子宮肌肉組織起保護(hù)作用，且調(diào)控歐洲野牛的季節(jié)性繁殖[12]?；羯鷸|等[13]認(rèn)為，未妊娠牦牛子宮中MT1mRNA的表達(dá)量顯著高于妊娠牦牛(P<0.01)，隨妊娠時(shí)間的增加,MT1蛋白表達(dá)也增加，說明MT1mRNA的表達(dá)對牦牛的妊娠起一定的調(diào)控作用。目前，對于MTR基因在羊子宮中表達(dá)的研究尚未見報(bào)道。本研究首次對MTR1amRNA在甘加型藏綿羊子宮組織中的相對表達(dá)進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)在甘加型藏綿羊發(fā)情后期，子宮組織中MTR1amRNA的相對表達(dá)量顯著高于發(fā)情前期和發(fā)情期，發(fā)情期的表達(dá)量最低。發(fā)情后期母羊已基本完成排卵，MT的分泌量增加，作用于下丘腦-垂體-性腺軸或通過血液循環(huán)直接與性腺器官上的MTR相結(jié)合，抑制或者促進(jìn)一些生殖相關(guān)激素的分泌，或調(diào)控性腺器官的一些生理活動(dòng)來抑制動(dòng)物發(fā)情。本研究結(jié)果也顯示，發(fā)情后期甘加型藏綿羊子宮組織中MTR1amRNA的相對表達(dá)量最高，說明MT在甘加型藏綿羊發(fā)情后期子宮組織中發(fā)揮作用，同時(shí)也反映MTR1amRNA的表達(dá)水平變化對甘加型藏綿羊發(fā)情周期子宮的生理活動(dòng)具有一定調(diào)節(jié)作用。

3.3 MTR1a 基因與甘加型藏綿羊季節(jié)性繁殖之間的關(guān)系

MT調(diào)控動(dòng)物生殖活動(dòng)是通過MT作用于下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)，引起一系列生殖激素的分泌發(fā)生變化，從而影響雌性動(dòng)物的生殖活動(dòng)，而在此過程中松果體起著聯(lián)系光照周期與季節(jié)性發(fā)情的紐帶作用。光照周期以及季節(jié)更替都能調(diào)控松果體MT的分泌, 下丘腦-垂體-性腺軸接收來自MT的信息并整合機(jī)體內(nèi)部生理變化后調(diào)控下丘腦 GnRH 的脈沖式釋放, 進(jìn)而調(diào)節(jié)垂體分泌促性腺激素(GTH)、促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)，促性腺激素作用于卵巢，引起雌激素(ER)和孕酮(P4)分泌[14-16]，確保動(dòng)物在1 a中最適時(shí)間進(jìn)行生產(chǎn)和繁殖[17]。朱雪雁等[18]在研究藏羊發(fā)情周期血漿中生殖激素的變化規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，在藏羊發(fā)情后期FSH和LH的平均含量最低，而E的平均濃度最高。葛聞博等[19]研究發(fā)現(xiàn)，GnRH激素在藏羊血漿中呈明顯的脈沖式分泌，在發(fā)情期平均濃度最高，顯著高于發(fā)情后期。而發(fā)情后期GnRH含量偏低可能是由于MT在發(fā)情后期分泌量升高抑制GnRH的釋放，進(jìn)而對甘加型藏綿羊發(fā)情起到抑制作用。

母羊的繁殖力主要由單胎產(chǎn)羔數(shù)和季節(jié)性發(fā)情決定，而常年發(fā)情綿羊的繁殖力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于季節(jié)性發(fā)情綿羊[5]。研究MTR1amRNA與季節(jié)性繁殖間的分子機(jī)制對于提高母羊繁殖力具有重要意義。Calvo等[20]發(fā)現(xiàn)，MTR1a基因與Rasa aragonesa綿羊的繁殖季節(jié)性狀有關(guān)。王世銀等[21]在研究季節(jié)性發(fā)情的阿勒泰羊和常年發(fā)情的湖羊時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者在其MTR1a基因序列5′端某些位點(diǎn)的突變存在差異，而這些位點(diǎn)很可能與綿羊的季節(jié)性發(fā)情有關(guān)。Mateescu等[22]和Carcangiu等[23]發(fā)現(xiàn)MTR1a基因外顯子2的604、605和612位堿基發(fā)生突變與母羊季節(jié)性繁殖性狀有關(guān)。雷夢媛等[5]研究發(fā)現(xiàn)MTR1a基因與綿羊的季節(jié)性繁殖作用機(jī)制有一定遺傳聯(lián)系，同時(shí)MTR1a基因也影響一些綿羊品種的產(chǎn)羔數(shù)。因此研究MT對季節(jié)性繁殖動(dòng)物生殖調(diào)控的機(jī)制重在研究其受體基因MTR1amRNA在季節(jié)性繁殖動(dòng)物內(nèi)分泌腺以及生殖器官中的表達(dá)規(guī)律。本研究從分子學(xué)水平探討甘加型藏綿羊發(fā)情周期子宮以及輸卵管中MTR1amRNA的表達(dá)規(guī)律，該結(jié)果為進(jìn)一步研究MT對羊季節(jié)性繁殖的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。