葉宇波，馬貴芳，潘瑤瑤，盧泳全

低氮脅迫對杉木幼苗生長及生理的影響

葉宇波，馬貴芳，潘瑤瑤，盧泳全

（浙江農林大學 林業(yè)與生物技術學院，亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

氮是植物生長發(fā)育過程中必不可少的營養(yǎng)元素。以FK，S39，S3和新6四個杉木無性系的萌芽條扦插苗為材料，采用營養(yǎng)液氣霧栽培法，分析低氮（low nitrogen，LN）脅迫對杉木不同無性系幼苗生長和生理的影響。結果表明，LN抑制杉木幼苗生長，促進根系的生長，降低葉片長寬比，增加根冠比；LN脅迫使葉片中丙二醛的含量增加，葉綠素a和葉綠素b的含量降低，可溶性蛋白的含量增加，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物歧化酶（POD）活性增加。

杉木；低氮脅迫；生長；生理；影響

氮素是核酸、氨基酸、蛋白質等物質的重要組分，是植物生長發(fā)育過程中必不可少的營養(yǎng)元素之一[1]。氮素參與一系列生理生化反應，涉及多種代謝途徑，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用[2-3]。缺氮對植物的產量和品質有很大的影響。植物對低氮脅迫響應分為兩個步驟[4]：首先在氮脅迫初期，在不嚴重影響生長的狀況下通過調節(jié)生理進程來適應短期的氮脅迫，包括三個方面：一是上調高親和力轉運系統(tǒng)，增加根的吸收速率[5]；二是在不影響光合作用下降低葉片的生長速率，并將產生的碳源盡可能多的分配給根系，增加根系密度和長度，提高氮素吸收率[6]；三是調控體內的氮儲備機制維持正常的生長代謝[7]。其次，隨著氮脅迫時間的延長，造成植物葉片不可逆的衰老，抑制植物生長。適當?shù)卦黾拥适┯昧渴侵参铽@得高產的必要措施之一，然而過量施用氮肥不僅降低了植物對氮素的吸收和利用效率，而且造成種植效益降低，資源浪費和環(huán)境污染等一系列問題[8-10]。挖掘植物自身對氮利用的潛力，篩選氮高效基因型是農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要研究領域。植物在不同氮水平下的生理應答是評價氮利用效率，篩選氮高效基因型的基礎。

杉木為杉科Taxodiaceae杉木屬裸子植物，是我國特有的速生優(yōu)良用材樹種，在南方各省廣泛種植[11-12]。中國亞熱帶地區(qū)被認為是氮沉降嚴重地區(qū)，因此有研究認為該地區(qū)林分已經由氮限制轉化為磷限制。然而鄭璐嘉等[13]利用δ15N研究了不同林齡杉木人工林氮穩(wěn)定同位素組成，利用細根δ15N值為指示，結果表明盡管中國亞熱帶地區(qū)氮沉降現(xiàn)象嚴重，但是氮素仍是處于速生期杉木人工林生長的限制因素，氮高效研究仍然是未來杉木育種的重要方向。

養(yǎng)分利用效率是品種高產的基礎。研究表明，植物在低氮脅迫下表現(xiàn)出各種適應機制, 在不同植物之間，甚至同一植物不同品種之間對氮素的利用效率存在顯著差異，這為人們篩選氮高效利用基因型進行遺傳改良提供了可能。篩選氮高效基因型，可以利用常規(guī)育種方法選育出氮利用效率高的品種，這是氮高效分子育種的材料基礎。目前, 氮高效杉木育種尚處于起始階段，因此本文研究低氮脅迫下杉木不同無性系的生長及生理變化，為杉木氮利用效率研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2013年10月采集浙江省開化林場杉木（118°42′ E，29°13′ N）無性系采穂圃中輪伐期為20～25年的中大徑材樹種新6、S39和F開×那24（簡稱FK）以及輪伐期為15 ~ 20年的中小徑材樹種S3共4個杉木無性系的當年萌芽條，于浙江農林大學試驗基（119°72′ E，30°23′ N）地扦插，第二年春天選取生長勢均一、根系完整，結構相對一致的無病害苗作為研究基礎材料，采用營養(yǎng)液氣霧栽培法。設置低氮（low nitrogen，LN）和對照（CK）兩個處理，每個處理5株，重復3次。由KNO3，Ca(NO3)2提供N源；用KCl和CaCl2來調節(jié)因NO3-濃度改變引起的其他離子濃度的改變，使之保持在恒定水平，除氮以外的營養(yǎng)以Hoagland營養(yǎng)液為基礎配方，在此基礎上根據(jù)前期預實驗結果進行適當調整，用于杉木的幼苗培養(yǎng)（表1），試驗從2015年5月20日開始到9月20日結束，各處理所用營養(yǎng)液每3周更新一次。

表1 杉木幼苗營養(yǎng)液配方

注：表中所有化學試劑均為實驗室分析純級。

1.2 試驗方法

LN脅迫處理開始后，每月20日用尺子測量各處理的苗高，跟蹤杉木幼苗生長變化趨勢。LN脅迫處理4個月后于9月20日分別收獲地上部分和地下部分，各處理隨機選取30個葉片，用游標卡尺（世達90501）測量葉長和葉寬，并計算葉片長寬比；用測樹鋼卷尺（太平洋）測量最長根長，用電子天平（英衡JCS-W）稱量地上部分和地下部分的鮮質量，并計算根冠比；用硫代巴比妥酸比色法[14]測定杉木葉片中丙二醛含量；用乙醇-丙酮提取法[15]測定杉木葉片中不同色素含量；用考馬斯亮藍法[16]測定杉木葉片中可溶性蛋白含量；根據(jù)鄒琦[17]的方法測定杉木葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化物歧化酶（POD）活性。試驗結果用SPSS.17軟件中的檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 LN脅迫對杉木無性系苗高生長的影響

由圖1可知，經4個月LN脅迫后4個杉木無性系幼苗苗高生長均受到抑制。隨著脅迫時間的增加4個無性系苗高生長均呈現(xiàn)先迅速增長，隨后生長速度變緩，并逐漸變的平緩。由圖1中可以發(fā)現(xiàn)，與CK相比，LN脅迫下各無性系生長隨著脅迫時間的增加呈現(xiàn)下降趨勢。

A－新6，B－S3，C－S39，D－FK。

Figure 1 Effect of low nitrogen treatment on growth of differentclones

2.2 LN脅迫對杉木無性系根生長的影響

由圖2可知，與CK相比，LN處理能使4個無性系的最長根長增加，但不同無性系杉木的最長根長受LN誘導伸長的程度存在差異。其中S39和FK在LN處理下的最長根長顯著高于CK（< 0.05），新6和S3的LN處理的根長極顯著高于CK（< 0.01）。其中以FK增幅最大，LN和CK處理的最長根長分別為36.0 cm和12.7 cm，LN處理較CK增加了23.28 cm。表明氮供給不足導致較多的生物量向根系分配，促進根系的生長，提高其吸收養(yǎng)分的能力。

** 表示LN處理與CK間差異極顯著（P < 0.01），*表示LN處理與CK間顯著差異（P < 0.05），下同。

Figure 2 The longest root length of seedlings treated by LN and CK

圖3 LN脅迫對杉木無性系葉片長寬比的影響

Figure 3 Comparison on leaf length breadth ratio

2.3 LN脅迫對杉木無性系葉片長寬比的影響

由圖3可知，LN脅迫下各無性系葉片的長寬比均下降。其中無性系新6和CK間的葉片長寬比達到顯著差異（< 0.05），S3與CK間的葉片長寬比達到極顯著差異（< 0.01），而S39和FK的葉片長寬比在LN脅迫與CK之間差異不顯著。

2.4 LN脅迫對杉木無性系根冠比的影響

由圖4可知，各無性系根冠比的比值均受到LN脅迫的影響，CK處理下地下部分生長量小于地上部分生長，4個無性系的比值均小于1；而LN脅迫下該比值都大于1，其中新6根冠比值最大，為2.225，F(xiàn)K根冠比值最小，為1.723。表明氮脅迫能促進地下部分生長，抑制地上部分生長，進而增加植物根系與土壤接觸面積，利于獲取更多的氮元素。

圖4 LN脅迫對杉木無性系根冠比的影響

Figure 4 Comparison on root/shoot ratio of seedlings

圖5 LN脅迫對杉木無性系丙二醛含量的影響

Figure 5 Comparison on MDA content in seedlings

2.5 LN脅迫對杉木無性系丙二醛含量的影響

由圖5可知，LN處理使4個杉木無性系丙二醛的含量均有所增加，但增加的幅度因無性系的不同而有差異，其中LN處理的新6，S3，F(xiàn)K中的丙二醛含量極顯著高于相應的CK（< 0.01），表明LN脅迫對杉木無性系幼苗有一定的毒害作用。

2.6 LN脅迫對杉木無性系葉片光合色素含量的影響

LN處理使光合色素含量顯著（< 0.05）或極顯著（< 0.01）低于CK（圖6），表明各無性系葉素a和葉綠素b合成均受到LN脅迫的抑制，但抑制程度不同。其中FK受到的抑制程度最大，其葉綠素a和葉綠素b均與CK間達極顯著差異水平（< 0.01）；S39的葉綠素b也與CK間達極顯著差異水平（< 0.01），其他無性系LN處理的葉綠素a和葉綠素b與CK間則均為差異顯著水平（< 0.05）。

2.7 LN脅迫對杉木無性系可溶性蛋白含量的影響

LN處理各杉木無性系可溶性蛋白的含量均有增加（圖7），其中LN處理的FK極顯著高于CK（< 0.01），新6和S39中可溶性蛋白含量顯著高于CK（< 0.05），而S3中的可溶性蛋白含量與CK間差異不顯著。

圖6 LN脅迫對杉木無性系光合色素含量的影響

Figure 6 Comparison on photosynthetic pigment in seedlings

圖7 LN脅迫對杉木無性系可溶性蛋白含量的影響

Figure 7 Comparison on soluble protein content in seedlings

2.8 LN脅迫對杉木無性系保護酶活性的影響

LN處理使各杉木無性系的SOD和POD活性均有所增加（圖8），其中LN處理下新6的SOD和POD活性與CK間差異達到極顯著水平（< 0.01），F(xiàn)K中的SOD和POD活性與CK間差異達到顯著水平（< 0.05），而另外兩個無性系的這兩種酶與CK間差異都不顯著。

圖8 LN脅迫對杉木無性系保護酶活性的影響

Figure 8 Comparison on SOD and POD activity in seedlings

3 結論與討論

Zhao等研究氮脅迫對高粱生長和生理的影響時發(fā)現(xiàn)，缺氮條件下其葉面積減小，生物量下降[18]。Chun等發(fā)現(xiàn)在缺氮條件下玉蜀黍的總根數(shù)增加，根系結構發(fā)生改變，這與任永哲的研究結果相似，他發(fā)現(xiàn)在LN脅迫下普通小麥的最長根長增加[19-20]。張定一等在研究不同基因型普通小麥LN脅迫的生理響應時發(fā)現(xiàn)普通小麥的根冠比在LN脅迫時明顯升高[21]。本研究發(fā)現(xiàn)LN脅迫對不同無性系杉木的苗高有不同程度的抑制作用。

葉綠體包含了植物光合作用的必需物質，是植物體進行光合作用的重要場所。在脅迫條件下，植物體葉片的結果和作用的完整性和穩(wěn)定性遭到損害，導致植物的光合作用受到影響[22]。Huang等在研究氮脅迫對稻葉片光合作用的影響時發(fā)現(xiàn)在氮缺乏的條件下稻的葉綠素含量降低[23]。本試驗中LN脅迫對杉木各無性系光合色素含量有不同程度的抑制作用。可溶性蛋白是植物體內普遍存在的一種滲透調節(jié)物質，葉片中可溶性蛋白50%左右是光合作用的關鍵酶RuBP羧化酶[25]。本研究表明LN脅迫對不同杉木無性系可溶性蛋白含量均有促進作用，各個無性系都有不同程度的增加。

SOD和POD是植物氧代謝過程中兩個極為重要的保護酶類，在生物體內具有清除氧自由基的作用。潘琦等研究發(fā)現(xiàn)在LN脅迫條件下苦草和黑藻的SOD與POD活性增加，表明了植物對外界環(huán)境的適應性[26]。劉宇等研究氮脅迫對超高產玉米葉片保護酶活性的影響時發(fā)現(xiàn)無氮處理水平下POD活性最高，并隨著施氮量的增加而逐漸降低；丙二醛含量隨著氮脅迫時間的延長逐漸增加[27]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)LN脅迫條件下杉木無系性葉片的POD和SOD的活性均增強，表明杉木增強了對LN脅迫的防御機制。

植物衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛是膜脂過氧化作用的產物之一，對細胞有很強的毒性，對細胞和細胞中的許多生物功能分子，如蛋白質、核酸和酶等都有很強的破壞作用，并對生物膜的結構和功能有一定的影響，其含量可以反應植物遭受逆境傷害的程度。本研究表明LN脅迫后期丙二醛含量增加，其中無性系新6的含量最高，說明該無性系質膜受損傷程度最嚴重。

氮是植物生長發(fā)育需求量最大的營養(yǎng)元素，既是構成植物有機體的結構物質,也是植物生理代謝過程中起催化作用的物質。篩選和培育耐LN脅迫基因型的植株是減少氮肥投入、降低環(huán)境污染的有效途徑之一。本試驗以主要生長和生理指標為基礎，分析了LN脅迫對杉木不同無性系幼苗生長的影響。從生長性狀來看，LN脅迫抑制杉木幼苗生長、促進根系的生長、降低葉片長寬比、增加根冠比；從生理指標看，LN脅迫使丙二醛的含量增加、光合色素含量顯著或極顯著降低、可溶性蛋白的含量增加、SOD和POD活性都增加。本試驗杉木各無性的綜合應答表現(xiàn)表明，LN脅迫下新6的丙二醛含量增加幅度相對較低，而保護酶的含量增幅較高，同時葉片中的葉綠素a和葉綠素b的含量降幅較小，推測新6在氮匱乏的營養(yǎng)環(huán)境適應性高于其它幾個無性系。

[1] 李梁，黃劍華，陳志偉，等. 作物耐低氮的相關生物學研究進展[J]. 上海農業(yè)學報，2012，28（02）：117－122.

[2] 張子義，伊霞，胡博，等. 缺氮條件下燕麥根軸細胞的程序性死亡[J]. 中國農學通報，2010，26（08）：175－178.

[3] 趙平，孫谷疇，彭少麟. 植物氮素營養(yǎng)的生理生態(tài)學研究[J]. 生態(tài)科學，1998，17（02）：39－44.

[4] RICHARD-MOLARD C，KRAPP A，BRUN F，. Plant response to nitrate starvation is determined by N storage capacity matched by nitrate uptake capacity in two Arabidopsis genotypes[J]. J Exp Bot，2008，59（4）：779－791.

[5] CRAWFORD N M，GLASS A D. Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants[J]. Trend Plant Sci，1998，3（10）：389－395.

[6] ZHANG H，F(xiàn)ORDE B G. Regulation of Arabidopsis root development by nitrate availability[J]. J Exp Bot，2000，51（342）：51－59.

[7] WALKER R L，BURNS I G，MOORBY J. Responses of plant growth rate to nitrogen supply: a comparison of relative addition and N interruption treatments[J]. J Exp Bot，2001，52（355）：309－317.

[8] 林鄭和，陳榮冰，陳常頌. 植物對氮脅迫的生理適應機制研究進展[J]. 湖北農業(yè)科學，2011，50（23）：4761－4764.

[9] ZHAO L Z. Efficient Management of Nitrogen Fertilizers for Flooded Rice in Relation to Nitrogen Transformations in Flooded Soils[J]. Pedosphere，2014，2（2）：97－114.

[10] ZHANG S，CAI G，WANG X，. Losses of urea-nitrogen applied to maize grown on a calcareous fluvo-aquic soil in North China Plain[J]. Pedosphere，1992，2（2）：171－178.

[11] 鄭仁華. 杉木遺傳育種研究進展與對策[J]. 世界林業(yè)研究，2005，18（13）：63－65.

[12] 孫長忠，沈國舫. 我國主要樹種人工林生產力現(xiàn)狀及潛力的調查研究Ⅰ.杉木、馬尾松人工林生產力研究[J]. 林業(yè)科學研究，2000，13（6）：613－621.

[13] 鄭璐嘉，黃志群，何宗明，等. 不同林齡杉木人工林細根氮穩(wěn)定同位素組成及其對氮循環(huán)的指示[J]. 生態(tài)學報，2016，36：2185－2191.

[14] 高峻鳳. 植物生理學實驗指導[M]. 高等教育出版社，2006：159－160.

[15] 張憲政. 植物葉綠素含量測定——丙酮乙醇混合液法[J]. 遼寧農業(yè)科學，1986，（3）：26－28 .

[16] 中國科學院上海植物生理研究所. 現(xiàn)代植物生理學實驗指南[M]. 科學出版，2004：214－215.

[17] 鄒琦. 植物生理學試驗指導[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2000.

[18] ZHAO D，REDDY K R，KAKANI V G，. Nitrogen deficiency effects on plant growth, leaf photosynthesis, and hyperspectral reflectance properties of sorghum[J]. Eu J Agron，2005，22（4）：391－403.

[19] 任永哲. 低氮脅迫對不同小麥品種苗期性狀的影響[J]. 種子，2012，31（05）：91－94.

[20] CHUN L，MI G，LI J，. Genetic analysis of maize root characteristics in response to low nitrogen stress[J]. Plant Soil，2005，276（1－2）：369－382.

[21] 張定一，張永清，楊武德，等. 不同基因型小麥對低氮脅迫的生物學響應[J]. 作物學報，2006，32（09）：1349－1354.

[22] 盧從明，張其德，匡廷云，等. 水分脅迫抑制水稻光合作用的機理[J]. 作物學報，1994，40（05）：601－606.

[23] HUANG Z A，JIANG D A，YANG Y，. Effects of nitrogen deficiency on gas exchange, chlorophyll fluorescence, and antioxidant enzymes in leaves of rice plants[J]. Photosynthetica，2004，42（ 3）：357－364.

[24] 楊晴，劉奇勇，白巖，等. 冬小麥不同葉層葉綠素和可溶性蛋白對氮磷肥的響應[J]. 麥類作物學報，2009，29（01）：128－133.

[25] PATTERSON T，MOSS D，BRUN W. Enzymatic changes during the senescence of field-grown wheat[J]. Crop Sci，1980，20（1）：15－18.

[26] 潘琦，鄒國燕，宋祥甫. 硝氮脅迫對不同沉水植物生理生長的影響[J]. 上海環(huán)境科學，2010，29（01）：16－20.

[27] 劉宇，韓林，王思遠，等. 低氮脅迫對超高產玉米葉片保護酶活性的影響[J]. 吉林農業(yè)大學學報，2011，33（01）：5－8，13.

Low Nitrogen Stress on Growth and Physiology ofSeedlings

YE Yu-bo，MA Gui-fang，PAN Yao-yao，LU Yong-quan

（State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, College of Forest and Biotechnology, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, China）

In October of 2013, stem cuttings of fourclones FK, S 39, S 3 and Xin 6 were harvested from Kaihua Forest Farm of Zhejiang province and were cultivated by aeroponic. Experiments were carried out on low nitrogen stress (LN) on growth and physiology of seedlings during the next May to September. The results showed that LN could inhibit the growth of seedlings, promote the growth of root system, decrease leaf length breadth ratio, and increase the root/shoot ratio. The content of MDA increased, chlorophyll a and b decreased in treated seedlings. The content of soluble protein, the activity of SOD and POD increased in seedlings treated by LN.

; low nitrogen stress; growth; physiology; response

S791.27

A

1001-3776（2019）06-0081-06

10.3969/j.issn.1001-3776.2019.06.013

2019-05-16；

2019-09-25

浙江農林大學大學生科研項目（102/202360000518）

葉宇波，本科生，從事林學方向研究；E-mail:1571109393@qq.com。

盧泳全，從事林木遺傳育種研究；E-mail:luyongquan@126.com。