吳 波， 葉 鑫， 陳 林， 楊 進(jìn)， 張漢超， 劉俊瑩， 陳 亮， 刁建軍

(1成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科， 2四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科，成都大學(xué)附屬醫(yī)院 3泌尿外科， 4中心實驗室， 四川 成都 610000)

腎癌對傳統(tǒng)放化療不敏感使免疫治療成為研究熱點，近年來雖然靶向治療在腎癌方面有所突破，但免疫治療仍然是晚期腎癌的標(biāo)準(zhǔn)治療[1]。免疫治療尤其是細(xì)胞因子治療可以讓一些患者完全緩解，而靶向藥物，如酪氨酸激酶抑制劑完全緩解率較低，這源于細(xì)胞因子治療與靶向治療機制完全不同[2]。靶向治療的機制是抑制腫瘤細(xì)胞增殖生長，而免疫治療既可抑制細(xì)胞增殖，還具有細(xì)胞毒作用從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。腎癌被廣泛認(rèn)為是免疫原性腫瘤，這正是免疫治療可以在一些患者中取得長期完全緩解療效的原因[3-4]。國外最新研究表明，Toll 樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)激動劑可以激活外周血細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對皮膚癌的免疫反應(yīng)[5]。本課題組前期運用TLR7激動劑刺激腎癌患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，亦發(fā)現(xiàn)多種抗腫瘤細(xì)胞因子表達(dá)增加，表明TLR7激動劑可能在腎癌免疫治療中有重要價值[6]。本研究在前期基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步將TLR7激動劑刺激后的腎癌患者PBMCs與來源于該患者術(shù)后標(biāo)本的原代腎癌細(xì)胞共培養(yǎng)，探索TLR7激動劑治療腎癌的潛能。

材 料 和 方 法

1 病例介紹

患者男，53歲。經(jīng)根治性腎切除術(shù)后病理確診為腎透明細(xì)胞癌，確診時未發(fā)現(xiàn)炎癥及其它合并癥。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，批件號《倫委批字2018D1》。

2 方法

2.1PBMCs的分離、培養(yǎng)及刺激 經(jīng)知情同意抽取腎癌患者血液20 mL，乙二胺四乙酸抗凝，離心分離血漿吸入1.5 mL環(huán)氧樹脂管中凍存?zhèn)溆谩ＪＳ嘌河昧姿猁}緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)稀釋，淋巴細(xì)胞分離液混勻梯度離心 PBMCs，小心吸取離心管中單個核細(xì)胞層，用PBS洗滌 2 次，最后以含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并記數(shù),調(diào)細(xì)胞含量為 2.5×108/L, 加入12孔板中(每孔2 mL)。TLR7 特異性激動劑 gardiquimod(EnzoLife Science)按照操作說明書進(jìn)行溶解，以10 mg/L的終濃度加入PBMCs 中[6]。

2.2腎癌細(xì)胞培養(yǎng) 原代細(xì)胞取自該患者腎癌標(biāo)本，采用混合酶消化法。將3～5代內(nèi)腎癌細(xì)胞接種于孔徑為0.4 μm 的12 mm Transwell(Life Sciences)板中(每孔0.5 mL)，Transwell外12孔板中加入含10% 胎牛血清 的 RPMI-1640培養(yǎng)基1.5 mL。貼壁后換無血清培養(yǎng)基同步細(xì)胞周期，然后與gardiquimod 刺 激4 h 后的PBMCs共培養(yǎng)24 h。實驗分2組進(jìn)行，分別是實驗(gardiquimod)組(gardiquimod 刺 激的PBMCs共培養(yǎng))和對照(control)組(未刺激的PBMCs共培養(yǎng))。

2.3ELISA檢測培養(yǎng)基中細(xì)胞因子水平 將PBMCs與腎癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，取上層細(xì)胞培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒(R&D)說明檢測培養(yǎng)液中γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)。比較實驗組和對照組3種細(xì)胞因子的表達(dá)水平。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測腎癌細(xì)胞周期 共培養(yǎng)24 h后將實驗組和對照組腎癌細(xì)胞消化，離心后棄上清，收取細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次。加入-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇1.5 mL，于4 ℃冰箱固定過夜。離心棄上清液，PBS洗滌離心除去乙醇。然后加入500 μL RNase(100 mg/L)37 ℃孵育1 h使雙股RNA降解，離心棄上清后加入1 mL溴化乙錠(propidium iodide，PI，50 mg/L)和0.2% Triton X-100避光孵育30 min。實驗方法參考秦曉平等[7]報道，以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測腎癌細(xì)胞周期，結(jié)果用細(xì)胞周期軟件分析。反應(yīng)細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)按照下列公式計算：細(xì)胞增殖指數(shù)(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) × 100%。

2.5[51Cr ]釋放實驗檢測Gardiquimod 刺激PBMCs抗腫瘤活性變化 將實驗組和對照組PBMCs作為效應(yīng)細(xì)胞，原代培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞，采用標(biāo)準(zhǔn)的 4 h [51Cr]釋放實驗檢測效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性。實驗前 24 h傳代腎癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞, 取 1 ×105個靶細(xì)胞,設(shè)置為效靶比40 ∶1、 20 ∶1和10 ∶1，同時設(shè)立自然釋放孔和最大釋放孔。作用時間為4 h,按以下公式計算各組的殺傷率：細(xì)胞殺傷活性(%)=[(實驗cpm-自放射cpm)/(靶細(xì)胞最大cpm-靶細(xì)胞自放射cpm)]×100%。

2.6Western blot檢測腎癌細(xì)胞中Skp2及其下游通路相關(guān)分子的蛋白水平 收獲共培養(yǎng)腎癌細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天公司)，操作在冰上進(jìn)行。將裂解的細(xì)胞液移入1.5 mL Ep管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min后吸取上清移入新管。取少量上清進(jìn)行定量，測定A值并計算蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣品調(diào)至等濃度，各組取30 mg蛋白樣品，通過SDS-PAGE分離后并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)上，然后用特異性抗體孵育。檢測的蛋白分別是GAPDH、p53、p27、p21和Skp2(Cell Signaling Technology)。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度值測量然后統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism軟件對資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計方法采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Gardiquimod 刺激PBMCs后多種細(xì)胞因子表達(dá)增加

Gardiquimod 刺激的PBMCs與腎癌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)基上清液內(nèi)IFN-γ、TNF-α和 IL-2 3種因子均明顯升高，IL-2較對照組升高約3倍，TNF-α較對照組升高約2倍，而IFN-γ較對照組升高約5倍(P<0.05)，見圖1。

2 Gardiquimod 刺激的PBMCs可明顯抑制腎癌細(xì)胞增殖

在共培養(yǎng)24 h后，各個樣本用流式細(xì)胞術(shù)檢測,統(tǒng)計分析顯示，實驗組PBMCs明顯抑制腎癌細(xì)胞從G1期過渡到S期，細(xì)胞的增殖指數(shù)從對照組的(51.58±4.90)%下降到實驗組的(40.83±4.87)%(P<0.05),見圖2。

Figure 1.The expression of IL-2, TNF-α and IFN-γ in culture medium supernatant were detected by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1實驗組與對照組培養(yǎng)基上清液IL-2、TNF-α和IFN-γ的水平

Figure 2.Flow cytometry assay of the cell cycle distribution. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖2實驗組與對照組的細(xì)胞周期分布分析

3 Gardiquimod刺激PBMCs后顯著提高其對腎癌細(xì)胞的殺傷率

實驗組PBMCs對腎癌細(xì)胞的殺傷率隨著效靶比的升高顯著提升；然而隨著效靶比的升高，對照組PBMCs對腎癌細(xì)胞的殺傷率升高不明顯。相同效靶比的情況下，實驗組較對照組的殺傷率顯著提升，隨著效靶比從10∶1逐漸提升為40∶1，2組PBMCs對靶細(xì)胞的殺傷率都逐漸提升(P<0.05),見圖3。

4 Gardiquimod 刺激PBMCs后共培養(yǎng)對腎癌細(xì)胞Skp2/p21/p27/p53蛋白水平的影響

我們進(jìn)一步檢測了gardiquimod刺激PBMCs后共培養(yǎng)對腎癌細(xì)胞Skp2/p21/p27/p53蛋白水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白水平在實驗組明顯下降(P<0.05)，下降的規(guī)律和細(xì)胞增殖指數(shù)的變化一致；實驗組p27蛋白水平明顯增加，與Skp2蛋白水平變化規(guī)律相反(P<0.05)，而p21和p53無明顯變化，見圖4。

Figure 3.Cytotoxicity of PBMCs to the renal cancer cells at different effector-target ratio. Mean±SD.n=3.△P<0.05vseffector-target ratio 20:1 group;#P<0.05vseffector-target ratio 10∶1 group;*P<0.05vscontrol group.

圖3在不同效靶比時PBMCs對腎癌細(xì)胞殺傷率的比較

Figure 4.The protein expression of Skp2, p21, p27 and p53 in the renal cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4各組腎癌細(xì)胞表達(dá)Skp2、p21、p27和p53蛋白水平的比較

討 論

晚期腎癌的治療是泌尿界和腫瘤界研究焦點，主要集中在免疫治療和靶向治療[8-11]。靶向治療藥物普遍價格昂貴，衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)問題已經(jīng)成為患者可及性的難題[12]。同時，靶向藥物如酪氨酸激酶抑制劑完全緩解率較低，而免疫治療尤其是細(xì)胞因子治療可以讓一些患者完全緩解，這源于細(xì)胞因子治療與靶向治療機制完全不同[2]。靶向治療的機制是抑制腫瘤細(xì)胞增殖生長，而免疫治療既可抑制細(xì)胞增殖，還具有細(xì)胞毒作用從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)gardiquimod刺激的PBMCs對腎癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用和抑制細(xì)胞增殖作用。提示TLR7激動劑,如gardiquimod可能是腎癌免疫治療的新型潛在藥物。目前未見類似報道。

探索藥物作用機制對新藥開發(fā)至關(guān)重要，課題組前期運用gardiquimod刺激腎癌患者PBMCs，亦發(fā)現(xiàn)多種抗腫瘤細(xì)胞因子基因表達(dá)增加，包括IFN-β、IFN-γ、TGF-β、TNF-α和NF-κB。同時發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8和IL-10等IL類因子表達(dá)增加。研究表明TLR7激動劑可能在腎癌免疫治療中有重要價值[6]。本研究在前期基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步將TLR7激動劑刺激后的腎癌患者PBMCs與來源于該患者術(shù)后標(biāo)本的原代腎癌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后培養(yǎng)基上清液內(nèi)IL-2、TNF-α和IFN-γ確實明顯升高。從基因表達(dá)和效應(yīng)水平雙重驗證了gardiquimod在腎癌中的免疫治療作用。該研究結(jié)果在基底細(xì)胞癌中也得到部分印證，另一種 TLR7激動劑imiquimod可以誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生IFN-α和TNF-α，從而有效殺傷基低細(xì)胞癌細(xì)胞[13]。國內(nèi)黃雪等[14]采用TLR激動劑在肺腺癌細(xì)胞中也取得相似的實驗結(jié)果。

免疫治療抑制腎癌細(xì)胞增殖的機制目前尚不清楚。細(xì)胞增殖最終依賴于細(xì)胞周期的進(jìn)展，它受到細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs)的負(fù)性調(diào)節(jié)[15-17]，腎癌細(xì)胞所含CDKIs分子種類繁多，包括p53、p21和p27等。有研究報道腎癌細(xì)胞增殖和Skp/p27有關(guān)[18]，最新的研究發(fā)現(xiàn)與p21有關(guān)[19]，也有發(fā)現(xiàn)與p21和p53同時相關(guān)的[20]。為澄清學(xué)術(shù)界的相關(guān)爭論，本研究將共培養(yǎng)后的腎癌細(xì)胞用于細(xì)胞周期檢測和Skp2/p21/p27/p53蛋白水平檢測，發(fā)現(xiàn)gardiquimod刺激PBMCs后可以明顯抑制腎癌細(xì)胞增殖，同時隨著Skp2表達(dá)下降腎癌細(xì)胞周期停滯，而p27顯著增加，p21和p53無明顯變化。實驗結(jié)果證實腎癌細(xì)胞周期調(diào)控可能與Skp2/p27通路有關(guān)。至于Skp2/p27通路的上游調(diào)控機制，國內(nèi)李婷婷等[21]提供了新的研究思路——轉(zhuǎn)錄因子 EB(transcription factor EB，TFEB)，將是未來深入研究的方向之一。