粱珍珍， 呂燕平， 張艷莉， 解玉東， 韓麗麗

(周口市中心醫(yī)院呼吸科， 河南 周口 466000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)性呼吸氣流受限為主要特征的慢性氣道炎性疾病，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)統(tǒng)計，20%的吸煙者會發(fā)展為COPD，終身吸煙者有50%發(fā)展為COPD[2]。而自噬在COPD發(fā)生和進(jìn)展發(fā)揮著重要作用[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在COPD患者和香煙提取物(cigarette smoke extract，CSE)暴露的小鼠肺組織切片的分析中發(fā)現(xiàn)，beclin-1和LC3的蛋白水平升高[3]。Li等[4]在支氣管上皮細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，在香煙提取物刺激下，自噬基因LC3表達(dá)上調(diào)，炎癥因子釋放的水平增強，兩者呈正相關(guān)。Chen等[5]在細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和香煙提取物誘導(dǎo)的小鼠COPD 模型發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞和炎癥因子生成增多，同時伴隨著自噬基因beclin-1表達(dá)上調(diào)。肺泡巨噬細(xì)胞是肺臟防御系統(tǒng)的第一道防線，暴露于香煙煙霧狀態(tài)下的肺泡巨噬細(xì)胞自噬水平異常，代謝紊亂，炎性因子分泌失常，可導(dǎo)致氣道炎癥發(fā)生與進(jìn)展[6]。因此，研究肺泡巨噬細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)作用對解釋COPD發(fā)生與進(jìn)展機制具有重要意義。

最近研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-181a(microRNA-181a,miR-181a)參與肺部炎癥發(fā)生與進(jìn)展[7-9]。而關(guān)于miR-181a調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞自噬與炎癥方面的研究偏少。本研究以大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383為研究對象，觀察miR-181a對CSE條件下NR8383細(xì)胞自噬和促炎因子分泌的影響，從一個新角度認(rèn)識miR-181a在COPD炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用，為評估m(xù)iR-181a是否可作為防治COPD的新靶點提供更多的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清購于PAA；Ham’s F12-K培養(yǎng)基購于Gibco；Cyto-ID細(xì)胞自噬體檢測試劑盒購于ENZO；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)購于Sigma；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)和IL-8 ELISA試劑盒購于武漢博士德生物公司；抗LC3-Ⅱ、beclin-1、p62和GAPDH抗體于購自Santa Cruz；miR-181a引物、miR-181a mimic(miR-181a-m)、mimic negative control (NC-m)和miR-181a inhibitor (miR-181a-i)和inhibitor negative control(NC-i)由上海吉瑪公司合成；Western blot實驗試劑套裝購于廣州賴德生物公司。

2 香煙提取物的制備

參照Kent等[10]文獻(xiàn)方法進(jìn)行提取CSE。取20支市售黃金葉牌香煙(焦油量11 mg，煙堿量1.0 mg,一氧化碳量11 mg)完全燃燒后產(chǎn)生的煙霧溶于20 mL無血清Ham’s F12-K培養(yǎng)基中，0.22 μm微孔過濾，此培養(yǎng)基視為CSE母液。實驗采用的CSE濃度為此培養(yǎng)基所占終體積的稀釋比例。

3 實驗方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)與CSE處理 NR8383細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的Ham’s F12-K培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次。取NR8383細(xì)胞以1×109/L的密度接種于6孔板，采用終濃度為5%、10%和20% CSE分別刺激細(xì)胞48 h。RT-qPCR檢測miR-181a的表達(dá)水平；ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6和IL-8的水平；并采用Spearman 相關(guān)分析法分析miR-181a的表達(dá)水平與TNF-α、IL-6和IL-8水平的相關(guān)性。

3.2miR-181a mimic與miR-181a inhibitor的轉(zhuǎn)染實驗 按照轉(zhuǎn)染說明書步驟，進(jìn)行 miR-181a mimic和miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染。取LipofectamineTM3000溶于100 μL無血清培養(yǎng)基，孵育5 min miR-181a mimic、NC-m、miR-181a inhibitor和NC-i分別溶于100 μL無血清培養(yǎng)基，孵育10 min；取含有LipofectamineTM3000的無血清培養(yǎng)基分別與含有miR-181a mimic、NC-m、miR-181a inhibitor和NC-i的無血清培養(yǎng)基輕柔混勻，室溫孵育25 min；將混合物分別加入800 μL含有1×106個NR8383細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中孵育6 h； 500×g離心細(xì)胞5 min，棄舊培養(yǎng)基，更換為6 mL 含10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。此細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

3.3細(xì)胞分組 細(xì)胞分組為正常對照組(control組，細(xì)胞正常培養(yǎng))、CSE處理組(20% CSE處理細(xì)胞)、CSE+miR-181a-m組(20% CSE處理miR-181a mimic轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、CSE+NC-m組(20%CSE處理NC-m轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、CSE+miR-181a-i組(20% CSE處理miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、CSE+NC-i組(20% CSE處理NC-i轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、3-MA組(5 mmol/L 3-MA處理細(xì)胞)、CSE+3-MA組(5 mmol/L 3-MA預(yù)處理細(xì)胞30 min，再用20% CSE處理細(xì)胞)、Rapa組(100 nmol/L Rapa處理細(xì)胞)和CSE+Rapa組(100 nmol/L Rapa預(yù)處理細(xì)胞30 min，再用20% CSE處理細(xì)胞)。以上各組細(xì)胞以1×109/L的密度接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.4ELISA檢測 取各組已處理后的NR8383細(xì)胞，800×g離心細(xì)胞5 min，離心收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，每組取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入已被抗體包被的96孔酶標(biāo)板，按照對應(yīng)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測TNF-α、IL-6和IL-8的含量。

3.5自噬體的檢測 取各組已處理后的NR8383細(xì)胞，1 000×g離心5 min收集細(xì)胞，PBS重懸2次，按照Cyto-ID細(xì)胞自噬體檢測試劑盒說明書方法，用250 μL 試劑盒緩沖液制備單細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)入激光共聚焦培養(yǎng)皿，加入250 μL Cyto-ID自噬檢測試劑，室溫避光30 min，激光共聚焦顯微鏡下(激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm)拍照，各組采用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描100個細(xì)胞，并統(tǒng)計每組平均單個細(xì)胞中Cyto-ID自噬點數(shù)。

3.6RT-qPCR實驗 提取各組已處理后NR8383細(xì)胞的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用TaqMan MicroRNA Assay Kit 的說明書，RT-qPCR檢測miR-181a的表達(dá)水平。各組細(xì)胞的cDNA、TaqMan MicroRNA Master Mix和miR-181a的正反向引物序列先95 ℃孵育5 min，然后進(jìn)行45個循環(huán)(95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、74 ℃ 25 s)進(jìn)行qPCR，以U6作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法計算表達(dá)水平。

miR-181a的上游引物序列為5’-TCACTCCTCTCCTCCCG-3’, 下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6的上游引物序列為5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’, 下游引物序列為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’ 。

3.7Western blot實驗 按照Western blot實驗試劑套裝說明書方法，提取細(xì)胞總蛋白，依次進(jìn)行SDS-PAGE、濕法電轉(zhuǎn)、PVDF膜封閉。待Western blot結(jié)束后，按抗體說明書方法分別孵育抗LC3-Ⅱ、beclin-1、p62和GAPDH抗體，暗室ECL發(fā)光顯影，Image-Pro Plus 6.0軟件掃描灰度值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。3～4組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析及Bonferroni-t檢驗，6組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-181a表達(dá)水平與CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)的相關(guān)性

選擇不同濃度(終濃度0、5%、10%和20%)的CSE分別處理NR8383細(xì)胞48 h，采用RT-qPCR檢測miR-181a 的表達(dá)，采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液促炎因子的含量。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，CSE濃度依賴性抑制miR-181a的表達(dá)(P<0.05),見圖1A。ELISA結(jié)果顯示，CSE濃度依賴性促進(jìn)NR8383細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8的生成(P<0.05),見圖1B。Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示miR-181a表達(dá)水平與TNF-α、IL-6和IL-8的水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),見圖1C。這些結(jié)果提示miR-181a可能參與CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

2 miR-181a參與調(diào)控CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，在CSE刺激下，miR-181a-i能進(jìn)一步抑制miR-181a的表達(dá)，而miR-181a-m能升高miR-181a的表達(dá)(P<0.05)，見圖2A。ELISA結(jié)果顯示，miR-181a-i能進(jìn)一步促進(jìn)NR8383細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8的生成，與CSE具有協(xié)同作用；而miR-181a-m能部分抑制CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8生成(P<0.05)，見圖2B。

3 自噬對CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

分別用自噬抑制劑3-MA和激動劑Rapa預(yù)處理細(xì)胞30 min，再用20% CSE處理細(xì)胞48 h，ELISA結(jié)果顯示，3-MA能進(jìn)一步促進(jìn)NR8383細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8的生成，與CSE具有協(xié)同作用；而Rapa能部分抑制CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8的生成(P<0.05)，見圖3A。同時，我們觀察了3-MA和Rapa對miR-181a表達(dá)的影響，我們發(fā)現(xiàn)3-MA和Rapa均對miR-181a表達(dá)不產(chǎn)生影響，見圖3B。進(jìn)一步觀察3-MA和Rapa對NR8383細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)無CSE刺激條件下，3-MA對LC3-Ⅱ、beclin-1和p62表達(dá)無影響，而Rapa升高LC3-Ⅱ和beclin-1表達(dá)，但對p62表達(dá)無影響；在CSE刺激條件下，3-MA能抑制CSE誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ和beclin-1表達(dá)，促進(jìn)p62表達(dá)；而Rapa能促進(jìn)CSE誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ和beclin-1表達(dá)，抑制p62表達(dá)(P<0.05)，見圖3C。這些結(jié)果提示自噬對NR8383細(xì)胞起保護(hù)作用，能部分抑制CSE誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

Figure 1.The level of miR-181a was negatively correlated with CSE-induced inflammatory response in the NR8383 cells. A: the expression level of miR-181a was detected by RT-qPCR; B: the levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 were detected by ELISA; C: miR-181a was negatively correlated with TNF-α, IL-6 and IL-8. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖1miR-181a表達(dá)水平與CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)

4 miR-181a參與調(diào)控NR8383細(xì)胞自噬

首先觀察CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞是否發(fā)生自噬現(xiàn)象。Cyto-ID檢測結(jié)果顯示，CSE濃度依賴性促進(jìn)NR8383細(xì)胞自噬體生成(P<0.05)，見圖4A；Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSE濃度依賴性促進(jìn)LC3-Ⅱ、beclin-1和p62表達(dá)，見圖4B。這些結(jié)果提示CSE誘導(dǎo)NR8383細(xì)胞自噬紊亂。進(jìn)一步，通過轉(zhuǎn)染miR-181a-m或miR-181a-i的方法改變 miR-181a的表達(dá)水平，觀察在CSE刺激的條件下NR8383細(xì)胞的自噬情況，Western blot檢測結(jié)果顯示，在CSE刺激下，miR-181a-i和miR-181a-m均能促進(jìn)LC3-Ⅱ和beclin-1表達(dá)；但miR-181a-i促進(jìn)p62表達(dá)，提示miR-181a-i加劇NR8383細(xì)胞自噬紊亂，而miR-181a-m抑制p62表達(dá)，提示miR-181a-m促進(jìn)NR8383細(xì)胞自噬，見圖4C、D。

討 論

慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病率和死亡率極高，且近年來其發(fā)病率呈高速增長趨勢[11]。而目前現(xiàn)有的COPD防治手段效果并不十分的理想，因此探索COPD的發(fā)病機制，尋找新靶點對COPD的治療具有重要的科學(xué)意義。

近來研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a可參與肺部炎癥性疾病的發(fā)病過程[7-9]。如過表達(dá)miR-181a mimic能顯著抵抗LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷和炎癥因子生成，而miR-181a inhibitor能加劇LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷和炎癥因子生成[7]；COPD患者肺組織和動物COPD模型中發(fā)現(xiàn)miR-181表達(dá)下調(diào)[8]；在急性肺損傷模型上，miR-181a通過下調(diào)靶基因Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，負(fù)調(diào)控LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌[9]。肺泡巨噬細(xì)胞是肺臟的主要細(xì)胞和防御系統(tǒng)的第一道防線，其與氣道炎癥性疾病發(fā)生和進(jìn)展直接相關(guān)[6, 12]。因此，本研究以香煙提取物誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383細(xì)胞炎癥模型為參考對象，發(fā)現(xiàn)CSE能濃度依賴性促進(jìn)促炎因子TNF-α、IL-6和IL-8生成；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在CSE條件下，抑制miR-181a表達(dá)能進(jìn)一步促進(jìn)NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)，與CSE具有協(xié)同作用；而過表達(dá)miR-181a能部分逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-8生成。這提示miR-181a負(fù)調(diào)控CSE誘導(dǎo)的NR8383肺泡巨噬細(xì)胞生成炎癥因子。

Figure 2.miR-181a was involved in the regulation of CSE-induced inflammatory responses in the NR8383 cells. A: the transfection efficiency of miR-181a mimic and miR-181a inhibitor examined by RT-qPCR; B: the levels of TNF-α, IL-6 and IL-8. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

圖2miR-181a參與調(diào)控CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)

自噬參與調(diào)控肺部炎癥性疾病的發(fā)病和進(jìn)展[3-6, 13-14]。如：SiO2致肺泡巨噬細(xì)胞自噬紊亂促進(jìn)炎癥相關(guān)因子的分泌[13]；BBC3通過肺泡巨噬細(xì)胞自噬促進(jìn)矽肺肺纖維化進(jìn)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CSE條件下，自噬抑制劑3-MA能進(jìn)一步促進(jìn)NR8383細(xì)胞炎性反應(yīng)，而激動劑雷帕霉素能部分逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞生成TNF-α、IL-6和IL-8，提示自噬抑制NR8383細(xì)胞的炎癥反應(yīng)功能，也能部分抑制CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥反應(yīng)。完整的自噬過程包含自噬體生成、自噬體結(jié)合降解底物、結(jié)合降解底物的自噬體與溶酶體融合、自噬底物降解4個過程[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CSE能促進(jìn)NR8383細(xì)胞自噬體的生成和LC3-Ⅱ、beclin-1和p62高表達(dá)。Beclin1參與自噬發(fā)生的初始階段，發(fā)揮啟動自噬的作用[16]；LC3-Ⅱ是自噬體形成的標(biāo)記物[17]；自噬底物p62能夠識別泛素化的降解底物，隨同降解底物一起被自噬體結(jié)合并降解、蛋白水平下調(diào)[18]。因此本結(jié)果提示CSE能促使自噬體生成，但自噬性降解阻滯，使得NR8383細(xì)胞自噬紊亂，導(dǎo)致炎癥因子生成增多。我們的研究還發(fā)現(xiàn)在CSE刺激下，miR-181a mimic和miR-181a inhibitor均能促進(jìn)LC3-Ⅱ和beclin-1表達(dá)；但miR-181a inhibitor能促進(jìn)p62表達(dá)，miR-181a mimic能抑制p62表達(dá)，提示在CSE刺激下，下調(diào)miR-181a能加劇NR8383細(xì)胞自噬紊亂，而上調(diào)miR-181a能促進(jìn)NR8383細(xì)胞自噬。雖然已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)關(guān)于miR-181a與自噬的關(guān)系和我們并不一致，如Tekirdag等[19]在MCF-7、 Huh-7和K562細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)miR-181a通過靶基因ATG5抑制自噬；Zhao等[20]在胃癌順鉑耐藥SGC7901/CDDP細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)miR-181a通過靶基因ATG5抑制自噬，從而增強胃癌細(xì)胞對順鉑敏感性。我們推測有以下幾個原因：首先，上述文獻(xiàn)作者只考察上調(diào)miR-181a能促進(jìn)LC3-Ⅱ和beclin-1表達(dá)，這和我們研究是一致的，但上述作者并沒檢測自噬性降解變化(如p62表達(dá))；其次，miR-181a是多功能miRNA，可能在不同細(xì)胞種類自噬調(diào)控存在差異；再次，刺激條件并不一致，我們采用的是CSE刺激誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥，并且炎性微環(huán)境中的炎癥因子也可能反饋影響細(xì)胞自噬流程。另外，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的閾值可能不同，造成的結(jié)果差異有待進(jìn)一步研究。

Figure 3.The effect of autophagy on the level of miR-181a and CSE-induced production of pro-inflammatory factors in the NR8383 cells. A: the level of TNF-α, IL-6 and IL-8 were detected by ELISA; B: the levels of miR-181a; C: the expression of LC3-Ⅱ,beclin-1 and p62. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

圖3自噬對NR8383細(xì)胞miR-181a水平和CSE誘導(dǎo)的促炎因子生成的影響

綜上所述，miR-181a調(diào)控CSE誘導(dǎo)的NR8383肺泡巨噬細(xì)胞炎癥，其作用機制可能與miR-181a調(diào)控CSE誘導(dǎo)的NR8383肺泡巨噬細(xì)胞自噬紊亂相關(guān)。以上結(jié)果提示miR-181a在COPD的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。

Figure 4.miR-181a was involved in the regulation of CSE-induced autophagy dysfunction in the NR8383 cells. A: representative images and quantitative analysis of Cyto-ID staining; B: Western blot for determining CSE-induced protein levels of LC3-Ⅱ, beclin-1 and p62; C: the effect of miR-181a inhibitor on CSE-induced protein expression of LC3-Ⅱ, beclin-1 and p62; D: the effect of miR-181a mimic on CSE-induced protein expression of LC3-Ⅱ, beclin-1 and p62. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

圖4miR-181a參與調(diào)控CSE誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞自噬功能障礙