趙 斌， 劉亞彬， 王光林

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬哈勵遜國際和平醫(yī)院普外二科, 河北 衡水 053000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一[1]，近年來隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸升高，結(jié)直腸癌發(fā)病率位于歐美發(fā)達國家惡性腫瘤第3位，死亡率則高居第2位[2]。在我國，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率居于惡性腫瘤中第5位[3]，嚴(yán)重影響著人們的健康水平。目前對于結(jié)直腸癌患者多采取手術(shù)治療的方式，可以獲得一定的效果，但是對于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者來說目前的治療方法仍是難點，因此，深入探討結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的機制以及針對其生物學(xué)特點開發(fā)出有效的靶向干預(yù)手段十分重要。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regu-lated kinase，ERK)是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族重要成員，p-ERK是其主要發(fā)揮功能的形式，p-ERK通過增強轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而增強其轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化和惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是ERK信號通路的下游因子，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分，調(diào)節(jié)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移行為[4]。

平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α protein，SM22α)是細(xì)胞骨架蛋白中的一種，其序列上的高度保守性提示這種蛋白具有相當(dāng)重要的作用[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SM22α能夠與肌動蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮，此外還具有穩(wěn)定和調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的作用。近期的研究顯示，SM22α可能作為抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，SM22α通過抑制ERK信號通路調(diào)節(jié)MMP-9的表達活性[6]，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定的作用。然而SM22α與結(jié)直腸癌侵襲和遷移之間的關(guān)系及機制研究仍未報道。本研究旨在體外驗證SM22α對結(jié)直腸癌侵襲和遷移的影響，探究ERK/MMP-9信號通路在其中發(fā)揮的功能，為結(jié)直腸癌患者的診斷和治療提供新思路。

材 料 和 方 法

1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116購自ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青公司；PD98059購自Sigma-Aldrich；SM22α過表達慢病毒由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建、篩選和包裝；RNA提取試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；兔抗人ERK、p-ERK和MMP-9抗體購自CST；兔抗人SM22α抗體購自Santa Cruz；鼠抗人β-actin抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3 d后用胰酶消化傳代，按1 ∶2或1 ∶3比例進行傳代，取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116正常培養(yǎng)傳代，SM22α過表達慢病毒預(yù)實驗感染人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116，確定慢病毒的MOI值。重懸調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染前用PBS清洗細(xì)胞，在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中加入5 mg/L的polybrene和相應(yīng)體積的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，使用2.5 mg/L嘌呤霉素進行篩選2～3周，熒光顯微鏡下檢測熒光蛋白的表達，RT-qPCR和Western blot檢測SM22α的mRNA和蛋白表達。

2.2Transwell遷移和侵襲實驗 取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的對照組及SM22α過表達組HCT116細(xì)胞用胰酶消化離心，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計數(shù)，吸取200 μL細(xì)胞懸液(每室2.0×104和4.0×104)加入上室(侵襲實驗4 h前在小室上室鋪50 μL稀釋Matrigel)，下室加入800 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(每組設(shè)置3個副室)；置于溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，36 h取出Transwell小室。用4%的多聚甲醛固定15 min，0.1%的結(jié)晶紫染色15 min，使用棉簽擦拭干凈上室未穿膜細(xì)胞，在倒置顯微鏡下隨機觀察并計數(shù)5個視野下的細(xì)胞數(shù)目。

2.3細(xì)胞劃痕實驗 細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度生長至90%～100%左右使用200 μL無菌槍頭沿直尺垂直進行細(xì)胞劃痕，PBS清洗懸浮脫落細(xì)胞并取劃痕處進行拍照(0 h)，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于6 h、12 h和24 h在同一劃痕位置進行拍照。精確測量劃痕平均間距，計算細(xì)胞遷移率和相對愈合率并分析實驗結(jié)果。

2.4MTT實驗 取對數(shù)生長期的對照組及SM22α過表達組HCT116細(xì)胞，按每孔5.0×103接種于6孔板，對照組和SM22α過表達組細(xì)胞各設(shè)5個復(fù)孔，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。加入含10% MTT的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，吸去上清液并加入150 μL DMSO，振蕩器振蕩混勻10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處檢測不同處理組吸光度(A值)，繪制細(xì)胞生長曲線。

2.5Western blot實驗 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化離心后，重懸成細(xì)胞懸液并進行計數(shù)，以每孔2×105接種于6孔板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長貼壁后取出并用4 ℃的PBS沖洗3次，每孔加入150 μL細(xì)胞裂解液(含PMSF)裂解細(xì)胞，將裂解下來的細(xì)胞吸入EP管中，放在渦旋振蕩器上振蕩30 s，冰上靜置10 min，然后于4 ℃、15 000 r/min高速離心15 min，收集上清液中的總蛋白。吸取5 μL上清液做蛋白定量，余下上清液內(nèi)加入6×loading buffer，在沸水中煮沸5 min，使蛋白質(zhì)變性。每組吸取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，待蛋白分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，加入 I 抗抗體4 ℃孵育過夜，次日經(jīng)TBST洗膜3次，每次10 min，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜液3次，每次10 min，使用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，目的蛋白通過與內(nèi)參照蛋白β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對比值。

2.6RT-qPCR實驗 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進行消化離心后，細(xì)胞傳代于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%～90%時按照飛捷RNAfast200試劑法提取RNA。從提取的RNA中吸取2 μL做RNA定量，并通過反轉(zhuǎn)錄得到穩(wěn)定的cDNA模板，反轉(zhuǎn)錄體系參照TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix試劑說明書。SM22α 的上游引物序列為5’-AGTGCAGTCCAAAATCGAGAAG-3’，下游引物序列為5’-CTTGCTCAGAATCACGCCAT-3’。使用β-actin作為內(nèi)參照，其上游引物序列為5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游引物序列為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。采用2-ΔΔCt計算方法進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

通過SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 構(gòu)建HCT116過表達SM22α細(xì)胞系

應(yīng)用SM22α過表達慢病毒感染HCT116細(xì)胞，構(gòu)建SM22α穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達細(xì)胞，使用Western blot和RT-qPCR檢驗SM22α蛋白和mRNA的表達，證實成功構(gòu)建SM22α過表達細(xì)胞，見圖1。

Figure 1.Construction of the SM22α-over-expressing HCT116 cells. A: Western blot was used to detect the protein expression of SM22α； B: RT-qPCR was applied to test the mRNA level of SM22α. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1構(gòu)建過表達SM22α的HCT116細(xì)胞

2 MTT實驗檢測SM22α對細(xì)胞活力的影響

與對照組相比，24 h和48 h細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，72 h細(xì)胞活力的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 SM22α過表達抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，見圖2。

3 SM22α抑制HCT116細(xì)胞的遷移能力

將對照組和SM22α過表達組HCT116細(xì)胞接種于6孔板，應(yīng)用細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SM22α過表達后HCT116細(xì)胞的遷移能力減弱，24 h劃痕愈合率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明SM22α過表達抑制HCT116細(xì)胞遷移，見圖3。

Figure 2.The effect of SM22α overexpression on cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2SM22α過表達對細(xì)胞活力的影響

Figure 3.The cell migration ability was detected by cell scratch test. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

4 SM22α過表達抑制細(xì)胞遷移和侵襲

HCT116細(xì)胞對照組和SM22α過表達組分別行Transwell 遷移和侵襲實驗。結(jié)果顯示，SM22α過表達組與對照組相比HCT116細(xì)胞的遷移能力降低(P<0.01)，在侵襲實驗中SM22α過表達組侵襲能力減弱(P<0.05)，說明SM22α抑制HCT116細(xì)胞遷移和侵襲，見圖4。

Figure 4.The cell migration and invasion abilities were measured by Transwell expriments. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

5 SM22α過表達抑制ERK和MMP-9蛋白水平

Western blot 檢測對照組和SM22α過表達組HCT116細(xì)胞MMP-9、p-ERK和ERK的蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達SM22α抑制MMP-9和p-ERK的蛋白水平(P<0.01)，見圖5A。同時使用PD98059阻斷ERK信號通路，檢測HCT116細(xì)胞MMP-9蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)阻斷ERK信號通路后，過表達SM22α不能抑制MMP-9蛋白表達，見圖5B。

Figure 5.The protein levels of ERK/MMP-9 were determined in the SM22α-over-expressing cells. A： the protein levels of MMP-9,ERK and p-ERK were detected by Western blot; B: ERK signaling pathway inhibitor PD98059 was used. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5SM22α過表達細(xì)胞中ERK/MMP-9蛋白水平的變化

討 論

近年來隨著國人飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐漸升高，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢，在臨床上針對結(jié)直腸癌的治療開發(fā)出了很多手段，如手術(shù)治療、化療和放療等，靶向治療主要用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌[7-8]。結(jié)直腸癌具有較強的侵襲遷移能力，肝、肺、腎等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌治療的難點和重點[9-10]。因此，深入研究和探索影響結(jié)直腸癌侵襲遷移的分子機制，發(fā)現(xiàn)其潛在的治療靶點具有重要的現(xiàn)實意義和臨床價值。

研究表明，SM22α除了可以調(diào)節(jié)和穩(wěn)定細(xì)胞骨架之外，還作為抑癌基因參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲遷移等生物學(xué)過程當(dāng)中，研究表明SM22α在前列腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]和肺癌[13]等腫瘤組織中表達降低。然而，在結(jié)直腸癌中關(guān)于SM22α對結(jié)直腸癌侵襲遷移能力的影響卻未有報道，本研究主要探討SM22α在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用。通過慢病毒轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建HCT116過表達SM22α細(xì)胞系，通過細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)SM22α過表達可抑制結(jié)直腸癌侵襲和遷移能力。

有研究發(fā)現(xiàn)SM22α可抑制MMP-9的表達，MMP-9在腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織[14]，此外MMP-9是重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解酶，能降解多糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分，增強癌細(xì)胞的侵襲能力，促進腫瘤細(xì)胞侵入相鄰組織并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。ERK是MAPK家族的重要組成，參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等[4]，既往研究發(fā)現(xiàn)MMP-9是ERK信號通路下游分子[15-16]。為了進一步探究分子機制，本研究通過Western blot檢測ERK、p-ERK和MMP-9蛋白水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SM22α過表達抑制p-ERK和MMP-9的蛋白水平。為了進一步驗證SM22α通過調(diào)節(jié)ERK/MMP-9信號通路發(fā)揮功能，應(yīng)用ERK抑制劑PD98059阻斷ERK信號通路，檢測SM22α過表達細(xì)胞MMP-9的表達水平，發(fā)現(xiàn)阻斷ERK信號通路后，SM22α過表達不能引起MMP-9表達下調(diào)，說明SM22α可能通過ERK/MMP-9信號通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌侵襲和遷移能力。

綜上所述，SM22α抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，抑制ERK/MMP-9信號通路是其可能的分子機制。進一步深入探究SM22α抑制結(jié)直腸癌侵襲遷移的分子機制，將可能發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療的新靶點，為提高結(jié)直腸癌的總體治療水平和預(yù)后起到重要作用。