李 賽， 潘 磊， 高瑞蘭， 趙燕娜， 余瀟苓， 尹利明△

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 浙江 杭州 310053； 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 浙江 杭州 310006)

蛇六谷是天南星科(Araceae)魔芋屬(Amorphophallus)多年生草本植物的干燥塊莖，又名魔芋、蒟蒻。經(jīng)考證，浙江地區(qū)藥用“蛇六谷”為花魔芋的塊莖[1-2]。本文所用蛇六谷提取物(the extract fromAmorphophalluskonjactuber，TuAKe)是天南星科魔芋屬花魔芋的干燥塊莖，經(jīng)用95%乙醇提取、乙酸乙酯萃取后再經(jīng)石油醚萃取回收溶劑而成。研究表明，蛇六谷石油醚萃取物能明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3-4];當(dāng)前蛇六谷多用于胰腺癌、乳腺癌和惡性淋巴瘤等惡性腫瘤中，對白血病的治療仍未有確切報道。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562由浙江省中醫(yī)院血液病研究所保存。IMDM培養(yǎng)基購自Gibco；小牛血清購自杭州四季青公司；TuAKe由浙江省中醫(yī)院中藥房用天南星科魔芋屬花魔芋的干燥塊莖以95% 乙醇提取、乙酸乙酯萃取后再經(jīng)石油醚萃取回收溶劑制成；PE標(biāo)記的小鼠抗人CD11b、CD14和CD42b 抗體購自BD；抗細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin E1)和紅系分化核轉(zhuǎn)錄因子GATA-1抗體購自 Cell Signaling Technology(CST)；抗β-actin抗體購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 將K562 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。TuAKe用IMDM培養(yǎng)基配成所需濃度, 脂溶物以DMSO助溶, DMSO 最終濃度小于0.1%。實驗分為對照(control)組、50 mg/L TuAKe組和100 mg/L TuAKe組。

2.2瑞氏-姬姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)的改變 取對數(shù)生長期的K562 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/L，分別加入不同濃度的TuAKe，分別接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105細(xì)胞(3 mL),TuAKe終濃度分別為0、50 和100 mg/L。上述培養(yǎng)體系置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液，培養(yǎng)3 d 后收集細(xì)胞，細(xì)胞離心涂片機(jī)制作細(xì)胞涂片。瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色法染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.3MTT比色法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/L，將各組細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔2×104/L細(xì)胞(200 μL)，復(fù)種6孔。上述培養(yǎng)體系置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入濃度為5 g/L 的MTT 20 μL，在相同條件下繼續(xù)孵育4 h。離心棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，微量振蕩器振蕩5 min，使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長的吸光度(A)值，計算各實驗組細(xì)胞生長的抑制率。該實驗重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

2.4K562細(xì)胞半固體集落形成實驗 計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/L，進(jìn)行K562白血病細(xì)胞集落培養(yǎng)，培養(yǎng)體系為IMDM培養(yǎng)液、30%新生牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U青/鏈霉素和0.3%瓊脂，接種于24孔板，每孔2.5×102個細(xì)胞(0.5 mL)，重復(fù)3 孔。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。以大于40個細(xì)胞的聚合為1個K562白血病細(xì)胞集落，記錄K562的細(xì)胞集落數(shù)，并計算抑制率(%)=(對照組集落數(shù)-實驗組集落數(shù))/對照組集落數(shù)×100%。同樣的實驗重復(fù)3次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 收集各組細(xì)胞，PBS洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，各組取100 μL細(xì)胞懸液，按試劑盒說明書將1 mL DNA staining solution和1 μL permeabilization solution分別加入各組細(xì)胞懸液中，4 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期，每個檢測標(biāo)本記錄10 000個細(xì)胞。MFL T32軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。同樣的實驗重復(fù)3次。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測分化相關(guān)抗原陽性表達(dá)率 收集各組細(xì)胞，PBS洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，取100 μL細(xì)胞懸液分別加入抗分化相關(guān)抗原CD11b、CD14和CD42b 的單克隆抗體，4 ℃孵育30 min，PBS洗去未結(jié)合的抗體，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞陽性表達(dá)率，每個檢測標(biāo)本記錄10 000個細(xì)胞。DIVA軟件進(jìn)行陽性率的分析。同樣的實驗重復(fù)3次。

2.7Western blot法檢測K562細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 按照本研究所已報道的方法，采用細(xì)胞裂解液(含50 mmol/L TRIS、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。制備SDS-PAGE凝膠，上樣量為每孔40 μg，80 V電泳6 h，電壓100 V轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白條帶轉(zhuǎn)至NC膜上，PBST洗膜3次，5% BSA封閉1 h，分別加抗CDK2、cyclin E1和GATA-1等抗體，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次后加入Ⅱ抗(購自聯(lián)科生物)孵育1 h，經(jīng)充分洗滌后用ECL發(fā)光劑采用灰度掃描系統(tǒng)測定并分析目的蛋白條帶。同樣的實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TuAKe誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變

鏡下顯示，TuAKe作用K562細(xì)胞3 d，相較于對照組，50和100 mg/L劑量組可見不同程度的細(xì)胞體積增大，細(xì)胞內(nèi)可見空泡，胞漿豐富，細(xì)胞核偏向一側(cè)，部分甚至出現(xiàn)裸核等形態(tài)學(xué)改變，見圖1。

2 TuAKe抑制K562細(xì)胞增殖

TuAKe處理K562細(xì)胞3 d，50和100 mg/L TuAKe 組的A值明顯低于對照組(P<0.01)。TuAKe處理K562細(xì)胞7 d，50和100 mg/L TuAKe組K562細(xì)胞的集落數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The morphological changes of K562 cells induced by TuAKe (×400)．

圖1TuAKe對K562細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 2.The viability of K562 cells detected by MTT assay and colony formation assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2MTT實驗和集落形成實驗證實TuAKe抑制K562細(xì)胞增殖

3 TuAKe對K562 細(xì)胞周期分布的影響

分別處理K562細(xì)胞3 d，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布情況,結(jié)果顯示在TuAKe作用下，50和100 mg/L組G0/G1期的細(xì)胞比例明顯增高，G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加，S 期細(xì)胞比例逐漸下降(P<0.05)，見圖3。

4 TuAKe提高K562 細(xì)胞分化相關(guān)抗原陽性表達(dá)率

TuAKe處理K562細(xì)胞7 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測K562 細(xì)胞分化程度，結(jié)果顯示K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原CD11b、CD14和CD42b的陽性表達(dá)率均明顯高于對照組(P<0.01)，見圖4。

5 TuAKe對K562細(xì)胞CDK2、cyclin E1和GATA-1蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

Western blot 實驗結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，TuAKe能夠下調(diào)K562細(xì)胞的CDK2和cyclin E1的表達(dá)，上調(diào)GATA-1的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

討 論

Cyclin E1調(diào)控細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，通過激活CDK2，調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂過程[5]。Cyclin E-CDK2復(fù)合物是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S 期的關(guān)鍵激酶，能促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S 期轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[6-8]。Cyclin E1表達(dá)上調(diào)是誘導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控異常導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要原因之一。研究表明[9]，cyclin E1在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中其表達(dá)見于整個細(xì)胞周期。我們的實驗結(jié)果顯示，TuAKe處理K562細(xì)胞72 h，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclin E1和周期蛋白依賴性激酶CDK2的表達(dá)，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，同時細(xì)胞阻滯在G2/M 期；同時，我們觀察到，濃度為50和100 mg/L TuAKe能夠顯著減少K562細(xì)胞集落形成的，抑制K562細(xì)胞增殖，抑制率達(dá)到41.9%～69.1%。MTT結(jié)果顯示50～100 mg/L TuAKe可明顯抑制K562細(xì)胞活力，抑制率達(dá)到25.1%～53.8%，說明TuAKe通過下調(diào)cyclin E1和CDK2的表達(dá)，部分阻滯K562細(xì)胞從G2/M進(jìn)入S期，抑制K562細(xì)胞增殖。

誘導(dǎo)分化是指利用分化誘導(dǎo)劑，不殺傷腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其細(xì)胞形態(tài)、功能及生物學(xué)行為等綜合指標(biāo)向正常細(xì)胞靠攏，使惡性腫瘤細(xì)胞具有分化為正?；蚪咏＜?xì)胞的能力。研究表明，K562細(xì)胞在體外被藥物誘導(dǎo)后可向巨核系、粒系、單核系或紅系分化[10-12]。我們觀察了TuAKe對K562細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用，結(jié)果顯示，在50～100 mg/L濃度范圍內(nèi)K562細(xì)胞可誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化。K562細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生變化，相較于對照組，各劑量組出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞體積增大，細(xì)胞內(nèi)空泡，細(xì)胞核側(cè)偏等形態(tài)學(xué)改變。我們檢測了粒系分化抗原CD11b、粒-單系細(xì)胞分化抗原CD14、巨核系分化抗原CD42b和紅系分化蛋白GATA-1，結(jié)果顯示分化相關(guān)抗原陽性表達(dá)率皆有不同程度的增高，紅系分化蛋白GATA-1表達(dá)增高，其促進(jìn)分化相關(guān)抗原陽性表達(dá)的作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，而50～100 mg/L劑量組范圍，各系分化的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明TuAKe具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)K562細(xì)胞多向分化的能力。

Figure 3.TuAKe changed the cell cycle distribution of the K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3TuAKe對K562細(xì)胞周期分布的影響

Figure 4.TuAKe changed the differentiation of the K562 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4TuAKe對K562細(xì)胞分化的影響

Figure 5.TuAKe regulated the protein expression of CDK2 and cyclin E1 in the K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5TuAKe對K562細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

目前人們試圖找到特異性更高、作用點更明確、不良反應(yīng)更小的藥物來抑制CDK2及其相關(guān)蛋白的活性，從而阻止腫瘤細(xì)胞的增殖以達(dá)到控制甚至根治腫瘤的目的已成為人們治療腫瘤的新方向[13-15]。TuAKe是目前常用的抗腫瘤及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的中藥，但目前對TuAKe殺死腫瘤細(xì)胞的有效化學(xué)成分、作用機(jī)制以及有效作用靶點尚不明確，對其毒性成分及其機(jī)制的研究也很少，所以作為抗癌中藥，TuAKe有著很高的研究價值，本研究首次將TuAKe應(yīng)用于慢性髓系白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖抑制研究中，并初步證實TuAKe抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)分化,其抑制K562細(xì)胞增殖的作用是通過下調(diào)cyclin E1和CDK2的表達(dá)并將細(xì)胞阻滯在G2/M期而實現(xiàn)的。