張 萍， 何曉剛， 徐曉丹， 張 露， 劉 雪， 劉亞坤， 姜 玉， 汪思應， 李菲菲△

(1安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院， 安徽 合肥 230032； 2上海健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院， 上海 201318)

乳腺癌是影響全球女性最普遍的腫瘤之一，乳腺癌遠處轉移引起顯著的病死率[1]。據(jù)統(tǒng)計，2015年美國報告的女性浸潤性乳腺癌病例數(shù)為231 840例，其中40 290例死亡[2]。乳腺癌侵襲性轉移的機制有很多，但近期大多數(shù)研究結果表明，在乳腺癌的侵襲性轉移過程中乳腺癌細胞上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)起重要作用[3-5]。腫瘤細胞發(fā)生EMT時細胞形態(tài)由上皮細胞形態(tài)變成梭形間充質細胞形態(tài)，細胞與細胞之間的黏附和極性喪失，并且伴有上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)表達降低，神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表達增加，遷移和侵襲能力增加，加強了原發(fā)腫瘤的傳播[6]。腫瘤細胞EMT的發(fā)生是由細胞、分子和腫瘤微環(huán)境共同參與的過程，不同的信號通路如轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、Notch和Wnt信號均可誘導EMT,它們的活性影響EMT相關轉錄因子的表達[7]。大量證據(jù)表明乳腺癌是一種侵襲性腫瘤，具有較高的EMT相關的轉移能力[8],探討EMT的發(fā)生機制對于了解乳腺癌侵襲轉移機制具有重要作用。

Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)是一種成骨細胞和骨組織形成的關鍵轉錄因子[9],它通過結合成骨細胞特異性元件2(osteoblast-specific element 2，OSE2)調控幾種與骨基質重建有關基因的表達[10-11]。Runx2及其靶基因在乳腺癌組織中高度表達，并且在乳腺癌骨轉移中起著重要作用[12]。由于腫瘤的轉移是一個源于EMT使腫瘤細胞從其起源部位形成多步驟的擴散過程，而EMT的發(fā)生使上皮細胞失去與周圍環(huán)境的聯(lián)系并獲得一種間充質表型, 協(xié)助腫瘤細胞從起源部位進入血液循環(huán)并遷移到遠處的器官[13-14]，那么Runx2是否能夠通過發(fā)生EMT使得乳腺癌細胞突破基底膜、定植到骨，從而引起乳腺癌的骨轉移？為了明確Runx2與乳腺細胞EMT的關系，我們用RNA干擾技術建立了穩(wěn)定敲減Runx2表達的高侵襲轉移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231，觀察比較了該細胞株的EMT相關表型和細胞侵襲轉移能力的改變，現(xiàn)將研究結果報告如下。

材 料 和 方 法

1 主要細胞、試劑

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231由美國合作實驗室引進,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)。Runx2 RNA干擾慢病毒(上海吉凱基因化學有限公司)；胎牛血清(天津康源生物技術公司)；嘌呤霉素(Sigma)；TRIzon Reagent(康為世紀生物科技有限公司)。PCR擴增儀(Biometra)；熒光倒置顯微鏡(ZEISS)；細胞培養(yǎng)箱和酶標儀(Thermo)；瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像儀FluorChem(上海晶檀生物有限公司)。

2 主要方法

2.1Runx2基因RNA干擾慢病毒載體的構建及包裝 由上海吉凱基因化學技術有限公司以 GV248 為載體，根據(jù)人Runx2 基因序列(NM_001024630) 設計并合成3條靶向短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA) 序列 [shRNA1 (5’-TACCTATCACAGAGCAATT-3’)、shRNA2 (5’-CAGTGATTTAGGGCGCATT-3’)和shRNA3 (5’-GCACTCCATATCTCTACTA-3’)]及1條陰性對照(control)shRNA序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)，并以此構建并包裝3種慢病毒載體及空載慢病毒載體。

2.2慢病毒感染 感染前一天將正常對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min后，離心，計數(shù)，按每孔細胞以5×104個接種于24孔板中，當細胞融合度達到45% 時開始病毒感染。病毒的MOI值為10(病毒滴度為1×107)感染效果最佳。棄去原培養(yǎng)基，將440 μL DMEM+10 μL Runx2-shRNA+50 μL polybrene加入1.5 mL EP管混勻后加入相應的孔中。12 h后，將培養(yǎng)基換成含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達。接著用濃度為0.5 mg/L的嘌呤霉素篩選，挑單個細胞克隆，進行擴大培養(yǎng)，建立低表達Runx2的穩(wěn)定的MDA-MB-231細胞系。

2.3基因表達檢測 RT-PCR檢測穩(wěn)定敲減Runx2表達的MDA-MB-231細胞中Runx2的mRNA表達水平。Runx2的上游引物序列為 5’-CCGGAATGCCTCTGCTGTTATGA-3’，下游引物序列為5’-ACTGAGGCGGTCAGAGAACAAACT-3’(238 bp)；β-actin的上游引物序列為5’-ACTGGTCTCAGTCAGTGTACAGC-3’，下游引物序列為5’-ACAGGAAGTCCCTTGCCATC-3’。對數(shù)生長期細胞棄去原培養(yǎng)基，每小皿加入1 mL TRIzon Reagent，槍頭反復吹打裂解細胞后移入1.5 mL EP管,分次加入氯仿、異丙醇和75% DEPC無水乙醇，提取RNA。取適量RNA進行逆轉錄，逆轉錄體系為:template RNA 3 μg，Oligo (dT) prime 1 μL，加入DEPC水至總體積為12 μL;混勻，金屬浴65 ℃ 5 min后，加入5×reaction buffer 4 μL、RiboLock RNase inhibitor(20 U)1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL和RevertAid M-MuLV RT (200 U) 1 μL，混勻，總體積為20 μL。反應條件為：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min。PCR體系為：2×Es Taq MasterMix 12.5 μL， 1×forward primer 1 μL, reverse primer 1 μL, template DNA 2 μL, DEPC水 8.5 μL，總體積25 μL。反應條件為：預變性 94 ℃ 2 min;變性 94 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，30個循環(huán)，終延伸 72 ℃ 2 min。取PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，凝膠成像儀拍片，計算不同條帶灰度值，不同組間進行比較。

2.4Western blot檢測Runx2和EMT相關蛋白的表達 收集對數(shù)生長期細胞，RIPA裂解提取總蛋白、SDS-PAGE分離及轉膜、封閉及 I 抗(1∶1 000)孵育過夜、次日TBST洗膜3次，每次10 min,再加入II 抗(1∶5 000)，搖床上室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min?；瘜W發(fā)光檢測，并測定灰度值。

2.5細胞侵襲實驗 實驗前進行細胞饑餓處理12 h。提前將基質膠于冰上融化成液態(tài)，將150 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基和50 μL的基質膠混勻。每個小室上室均勻鋪30 μL稀釋的基質膠后，將小室置于24孔板里于孵箱中30 min，使膠凝固。取處于對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化并離心，制成單細胞懸液，調整濃度至1×109/L。待小室的膠凝固后，每組細胞設2個復孔，每孔3×105cells，小室上室無血清的DMEM培養(yǎng)體系每孔200 μL，加入相應體積的細胞懸液，下室加500 μL完全的DMEM培養(yǎng)基。將24孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收板。棄去上室培養(yǎng)液，棉簽輕擦去上室中未穿過膜的細胞。加4%多聚甲醛結晶紫固定并染色2 h后。PBS清洗上室3次，室溫干燥后，顯微鏡下觀察、拍攝圖片，每孔隨機選取5個視野拍照并計數(shù)。實驗重復3次。

2.6軟瓊脂集落形成實驗 實驗前將水浴鍋設置為60 ℃(維持瓊脂糖膠呈液態(tài))，按1∶1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM完全培養(yǎng)基(含20% 胎牛血清和2%青、鏈霉素)充分混合制備下層膠，每孔取1.5 mL鋪于6孔板中(槍頭稍留點，不全打完，避免產(chǎn)生氣泡)，封口膜封板，于平整冰面上冷卻凝固(約45 min)。在等待下層膠凝固的時間中，取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化離心，制成細胞懸液，調整細胞濃度至1×107/L。鋪上層膠,每孔3 000 cells，每組細胞設2個復孔，取900 μL細胞懸液加入到600 μL 2×DMEM完全培養(yǎng)基中混勻，再加1.5 mL 0.7%的瓊脂糖，充分混勻后取1 mL后注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中。冷卻凝固后，加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基，保持瓊脂的濕潤度。置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。收板，顯微鏡下觀察、拍攝圖片，每孔隨機選取5個視野拍照并計數(shù)。實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Bonferroni 校正的t檢驗進行各組間均數(shù)的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 成功建立Runx2表達抑制的乳腺癌細胞系

慢病毒轉染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達，并用嘌呤霉素篩選2～3周，直至熒光倒置顯微鏡下觀察所有的細胞均能夠穩(wěn)定表達GFP熒光時，說明成功建立了穩(wěn)定敲低Runx2表達的細胞株，見圖1。敲低Runx2表達的MDA-MB-231乳腺癌細胞株(Runx2-shRNA3)中Runx2的mRNA和蛋白含量明顯低于常規(guī)MDA-MB-231乳腺癌細胞和轉染慢病毒陰性載體的MDA-MB-231乳腺癌細胞(P<0.05)，提示在本實驗中 Runx2-shRNA3組干擾效率好，并應用于后續(xù)實驗中；未轉染(control)組和陰性對照(NC)組的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

2 敲減Runx2表達抑制乳腺癌細胞EMT過程

與正常MDA-MB-231細胞相比，敲減Runx2表達的MDA-MB-231細胞呈多邊形，細胞之間變得更加緊密，呈現(xiàn)上皮樣改變,這一現(xiàn)象提示敲減MDA-MB-231細胞中Runx2的表達可能抑制EMT過程，促使細胞發(fā)生間充質細胞上皮化，見圖3A;隨后我們采用Western blot檢測不同組中EMT相關標志物 E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的蛋白表達，結果顯示敲減Runx2表達的MDA-MB-231細胞中E-cadherin蛋白明顯高于常規(guī)MDA-MB-231細胞和轉染慢病毒陰性載體的MDA-MB-231細胞(P<0.05)，未轉染組和陰性對照組的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3B;敲減Runx2表達的MDA-MB-231細胞的N-cadherin、β-catenin和MMP-9蛋白水平明顯低于常規(guī)MDA-MB-231細胞和轉染慢病毒陰性載體的MDA-MB-231細胞(P<0.05)，未轉染組和陰性對照組的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3B。

Figure 1.Knock-down ofRunx2 expression by lentiviral vector infection in MDA-MB-231 cells (×200).

圖1建立穩(wěn)定表達GFP熒光的乳腺癌細胞系

Figure 2.The mRNA and protein expression of Runx2 with or without infection with lentiviral vector in MDA-MB-231 cells detected by RT-PCR and Western blot. A: the mRNA expression of Runx2 was obviously inhibited in Runx2-shRNA3 group; B: the protein expression of Runx2 was obviously inhibited in Runx2-shRNA3 group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖2成功建立Runx2表達抑制的乳腺癌細胞系

Figure 3.Mesenchymal-to-epithelial transition of MDA-MB-231 cells after down-regulating the expression ofRunx2. A: the cell morphological changes were observed under reverted microscope (×200); B: the relative protein expression of Runx2 and the EMT markers E-cadherin, N-cadherin, β-catenin and MMP-9 in the MDA-MB-231 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖3Runx2低表達抑制乳腺癌細胞EMT過程

3 抑制Runx2表達可以抑制高侵襲轉移性乳腺癌細胞的侵襲能力

通過以上研究我們發(fā)現(xiàn)，下調Runx2的表達可致MDA-MB-231細胞的EMT也受到抑制，因此我們進一步檢測了敲減Runx2表達后細胞的侵襲轉移能力是否也受到了抑制。通過細胞侵襲實驗，我們發(fā)現(xiàn)敲低Runx2表達的MDA-MB-231細胞與正常MDA-MB-231細胞相比，侵襲能力明顯下降(P<0.05)，未轉染組和陰性對照組的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4A，說明抑制Runx2表達可以抑制高侵襲轉移性乳腺癌細胞的侵襲能力。

通過軟瓊脂集落形成實驗，我們檢測了敲減Runx2表達后細胞的非錨定生長能力，發(fā)現(xiàn)敲減Runx2表達的MDA-MB-231細胞與正常MDA-MB-231細胞相比，細胞形成集落的數(shù)目以及體積明顯降低(P<0.05)，未轉染組和陰性對照組的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4B,說明抑制Runx2表達可以抑制高侵襲轉移性乳腺癌細胞的非錨定生長能力，降低了腫瘤細胞的惡性生物學行為，進而影響了腫瘤細胞侵襲轉移能力。

討 論

Runx2是屬于Runx基因家族的轉錄因子，有一個保守的Runt DNA 結合域，編碼與果蠅同源的蛋白[15]。最初，Runx2被認為是骨骼發(fā)育的一個主要的調節(jié)因子[16]。迄今為止，大量的證據(jù)表明Runx2和乳腺癌轉移密切相關[17]。Runx2高表達于更傾向骨轉移的乳腺癌細胞系和乳腺原發(fā)組織中[18-19]。有證據(jù)表明在乳腺癌細胞中，Runx2能夠調節(jié)與骨轉移有關的基因和基質金屬蛋白酶的表達，促進乳腺癌降解細胞基質，破壞基底膜侵入血管或淋巴管，有利于腫瘤細胞在遠處轉移部位的定植[20-21]。而上皮間充質化是惡性腫瘤進展過程中腫瘤獲得浸潤、遷移和遠處轉移能力的重要機制[22]。EMT的發(fā)生是上皮細胞通過復雜的細胞和微環(huán)境改變獲得間充質表型，比如上皮標志物的降低，間充質樣標志物的表達上調，細胞骨架的重組和基底膜的降解導致細胞間連接丟失，從而促進這些細胞的侵襲和運動能力[3]。

Figure 4.Inhibition ofRunx2 expression decreased the invasion ability of high invasive metastatic breast cancer MDA-MB-231 cells. A: the invasion ability of MDA-MB-231 cells was inhibited afterRunx2 expression knock-down; B: inhibition ofRunx2 expression inhibited anchorage-independent growth of human breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖4抑制Runx2表達可以抑制高侵襲轉移性乳腺癌細胞的侵襲能力

因此，我們推測Runx2除了對腫瘤相關轉移骨定植和基底膜突破發(fā)揮作用外，是否能夠參與腫瘤細胞誘導EMT的發(fā)生，從而最終影響細胞的侵襲和轉移能力。

本研究中我們選取Runx2表達水平較高的MDA-MB-231細胞，轉染敲減Runx2表達的慢病毒載體。通過Western blot和RT-PCR驗證了Runx2的敲減效率，結果顯示敲減Runx2表達的MDA-MB-231細胞中上皮標志物E-鈣黏蛋白被誘導，間充質標志物N-鈣黏蛋白被明顯抑制，降解細胞基底膜的蛋白酶MMP-9被抑制，參與誘導EMT的經(jīng)典WNT信號通路的β-catenin蛋白表達被抑制。這些結果表明敲低Runx2的表達能夠抑制EMT。同時我們通過侵襲實驗和軟瓊脂集落形成實驗結果顯示，干擾Runx2可抑制細胞EMT的過程，從而抑制了細胞的侵襲轉移能力。我們的研究提示，抑制Runx2的表達可以有效地干擾侵襲性較高的乳腺癌細胞的EMT過程，從而對乳腺癌細胞的侵襲能力起到抑制作用。但Runx2通過轉錄激活下游何種蛋白來影響EMT的過程仍在進一步研究中，我們初步的研究結果發(fā)現(xiàn)這一過程可能與一種重要的細胞因子——TGF-β有關，相關實驗仍在進行中。本研究為今后以Runx2為核心，發(fā)現(xiàn)有效治療靶點，干預乳腺癌的侵襲和轉移提供了重要的思路和研究方向。