孫玉成 劉曉巍 片光哲

作者單位：133000 延吉 延邊大學附屬醫(yī)院普外科

放療是直腸癌重要的治療手段，可以提高保肛率和增加手術切除率，還可延長復發(fā)患者生存期，提高生活質量［1］。然而，直腸癌對放療的敏感性存在較大個體差異，部分患者有放療抵抗，嚴重影響放療效果［2］。二甲雙胍（DMBG）是傳統(tǒng)的降糖藥物，近年來在抗腫瘤方面的作用引起了研究者的關注。有研究表明，DMBG可增加卵巢癌對化療藥物的敏感性［3］，在胰腺癌、鼻咽癌、宮頸癌放療中也具有一定增敏作用［4-6］，而其對直腸癌放療的增敏作用，目前相關研究報道較少。本研究從體內外觀察DMBG對直腸癌放療敏感性的影響并探討其可能的作用機制，為提高直腸癌放療療效尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

直腸癌SW1463細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，4～5 d傳代1次，傳代5次后置于-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?。本實驗所用裸鼠為近交系雌性BALB/c裸鼠，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，8～10 周齡，質量為 20～23 g，具有相同遺傳背景，共50只，在延邊大學中心實驗室SPF級條件下飼養(yǎng)，裸鼠健康狀況良好（合格證號：SCXK 20080002）。實驗動物的飼養(yǎng)和處理經延邊大學附屬醫(yī)院動物倫理管理委員會審核同意。

鹽酸二甲雙胍購自上海廣銳生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Life Technologies公司，MTT試劑盒購自美國Sigma公司，γ-H2AX、DNA-PK蛋白檢測試劑盒、兔抗γ-H2AX多克隆抗體購自美國Trevigen公司，β-actin抗體、鼠抗DNA-PK單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。流式細胞儀購自美國BD公司，CO2恒溫箱購自美國Thermo Scientific公司，酶標儀購自美國Biotek公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，Clinac 600C/D型直線加速器購自美國Varian公司，凝膠圖像分析管理系統(tǒng)為北京科創(chuàng)銳新生物凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 MTT法檢測細胞活力

取對數生長期直腸癌SW1463細胞，消化后制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/L，設實驗組和對照組，分別接種于96孔板，每孔100 μL，每組設5個復孔。實驗組加入用PBS配制的DMBG，根據預實驗結果并參照相關文獻［7］，使DMBG終濃度分別為5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L；對照組僅用等量PBS液處理，每組設調零組，加入MTT液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后按美國Sigma公司MTT試劑盒說明書要求和步驟操作，用酶標儀測定450 nm波長處光密度值D（λ），計算細胞活力及IC50。細胞活力（%）=［D（λ）實驗組-D（λ）調零組］/［D（λ）對照組-D（λ）調零組］×100%，實驗重復 3次。

1.3 克隆集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力

取對數生長期SW1463細胞，接種于96孔板，設對照組、DMBG組、單純照射組、DMBG+照射組，每組設5個復孔，DMBG取 10 mmol/L（約 20%IC50濃度），對照組用等量PBS液處理，藥物作用24 h后，照射組與 DMBG+照射組分別給予 0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy劑量照射，將各組細胞鋪板于60 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，2周后甲醇固定，結晶紫染色，鏡下計數大于50個細胞克隆數，計算細胞克隆形成率，根據細胞克隆形成率計算細胞存活率。細胞克隆形成率（%）=（克隆數/接種細胞數）×100%，細胞存活率=各實驗組細胞克隆形成率/對照組細胞克隆形成率，繪制細胞存活曲線。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡

取對數生長期SW1463細胞，按上述“1.3”分組方法，參照文獻［8］及預實驗結果，照射組、DMBG+照射組的照射劑量取4 Gy（照射組細胞凋亡率約為20%的照射劑量），培養(yǎng)48 h后收集細胞，上流式細胞儀檢測對照組、DMBG組、照射組、DMBG+照射組細胞周期，加Amiexin-V-FITC/PI標記后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，具體操作步驟按試劑盒說明書要求進行。實驗重復3次。

1.5 免疫印跡法檢測γ-H2AX、DNA-PK蛋白的表達

分組方法同上述“1.3”，將SW1463細胞接種于96孔板，每組設5個復孔，對照組與DMBG組不照射，照射組、DMBG+照射組用4 Gy劑量照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照Trevigen公司試劑盒說明書要求和步驟進行操作，利用北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司的凝膠成像系統(tǒng)測定目的蛋白條帶凈灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin的蛋白條帶灰度值比值確定目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.6 建立裸鼠移植瘤模型

取對數生長期SW1463細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后吹打成細胞懸液，用PBS液洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，重復2次，棄上清液，加PBS液將離心后沉淀的SW1463細胞稀釋至1.5×107/mL。取上述稀釋好的SW1463細胞0.2 mL注射于裸鼠上腹部皮下，1周后觀察，共有48只裸鼠造模成功，瘤體大小約為10 mm×10 mm。

1.7 荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線及抑瘤率檢測

將建模成功的48只裸鼠按隨機數字表法分為4組，每組12只：對照組給予質量濃度為0.9%的NaCl注射液；DMBG組注射DMBG；照射組給予質量濃度為質量濃度為0.9%的的NaCl注射液并照射；DMBG+照射組注射DMBG并照射，藥物作用2周，DMBG用質量濃度為0.9%的NaCl注射液溶解，濃度為100mg/mL，DMBG組及DMBG+照射組每只裸鼠每天腹腔注射50 μL DMBG，對照組及照射組僅給予等量質量濃度為0.9%的NaCl注射液進行腹腔注射，照射組及DMBG+照射組進行一次性照射，根據預實驗結果并參照文獻［8］，照射劑量為6 Gy。每周用游標卡尺測量每只裸鼠瘤體的長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積（V=0.52×a×b2），根據腫瘤體積變化繪制腫瘤生長曲線，至6周時用異氟烷過量麻醉法處死裸鼠，完整取出瘤體并稱重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件對數據進行處理和分析，計量資料符合正態(tài)分布，結果以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍對SW1463細胞活力的影響

MTT實驗結果顯示，作用48 h后，IC50為51.20 mmol/L，對照組和 5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L DMBG 組的細胞活力分別為（92.31±7.25）%、（87.93±10.02）%、（78.56±9.32）%、（67.63±11.17）%、（54.39±8.41）%、（21.95±6.38）%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=43.283，P=0.021），5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L DMBG 組分別與對照組比較，細胞活力均顯著降低（t=2.486，3.741，6.023，8.375，11.247；P=0.039，0.031，0.007，0.005，0.002）。

2.2 二甲雙胍聯合放療對SW1463細胞存活率的影響

實驗結果顯示，2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 照射，DMBG組、照射組和DMBG+照射組的細胞存活率組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），DMBG+照射組分別與DMBG組及照射組比較，細胞克隆形成能力明顯下降，細胞存活率明顯降低（P＜0.05），見表1、圖 1。

表1 不同處理組SW1463細胞的存活率（n=5,%）Tab.1 Survival rate of SW1463 cells in different treatment group（n=5,%）

圖1 SW1463細胞的存活曲線Fig.1 Survival curves of SW1463 cells

2.3 二甲雙胍聯合放療對SW1463細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，對照組細胞凋亡率為（3.82±3.03）%，DMBG組細胞凋亡率為（16.19±4.38）%，照射組細胞凋亡率為（17.24±5.17）%，DMBG+照射組細胞凋亡率為（63.32±6.15）%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=39.432，P=0.032）；DMBG+照射組分別與DMBG組及照射組比較，細胞凋亡率明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（t=8.287，9.074；P=0.037，0.031），見圖2。

圖2 DMBG聯合放療對SW1463細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of DMBG combined with radiotherapy on apoptosis of SW1463 cells

2.4 二甲雙胍聯合放療對SW1463細胞周期的影響

細胞周期檢測結果顯示，DMBG+照射組G0/G1期細胞比例減少，S期變化不大，G2/M期細胞比例增加，與DMBG組及照射組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明DMBG聯合放療后可促使SW1463細胞周期向放療敏感的G2/M偏移，見表2。

表2 DMBG聯合放療對SW14631細胞周期的影響（n=5）Tab.2 Effect of DMBG combined with radiotherapy on SW14631 cells cycle（n=5，%）

2.5 二甲雙胍聯合放療對γ-H2AX、DNA-PK蛋白表達的影響

免疫印跡法檢測結果顯示，與DMBG組及照射組比較，DMBG+照射組可上調DNA損傷蛋白γ-H2AX蛋白的表達，下調DNA損傷修復蛋白DNA-PK蛋白的表達（P＜0.05）。見表 3、圖 3。

表3 DMBG聯合放療對γ-H2AX及DNA-PK蛋白表達的影響（n=5）Tab.3 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the expression of γ-H2AX and DNA-PK protein（n=5）

圖3 DMBG聯合放療對γ-H2AX、DNA-PK蛋白表達的影響Fig.3 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the expression of γ-H2AX and DNA-PK proteins

2.6 二甲雙胍聯合放療對裸鼠移植瘤生長的影響

用藥6周后，完整取出實驗組和對照組裸鼠瘤體稱重并計算抑瘤率，結果顯示，DMBG組、照射組和DMBG+照射組抑瘤率分別為（20.74±2.61）%、（31.52±3.43）%和（68.51±2.58）%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=93.275，P=0.037），且 DMBG+照射組抑瘤率明顯高于DMBG組及照射組（P＜0.05）。DMBG+照射組裸鼠移植瘤體積和移植瘤重量均明顯變小，與照射組及DMBG組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 4、圖 4。

表4 DMBG聯合放療對裸鼠移植瘤生長的影響（n=12）Tab.4 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the growth of transplanted tumor in nude mice（n=12）

圖4 裸鼠移植瘤的生長曲線Fig.4 Growth curves of transplanted tumor in nude mice

3 討論

直腸癌近年發(fā)病率呈上升趨勢，放療為其重要的治療手段，提高患者對放療的敏感性對預后有重要影響。二甲雙胍作為一種降糖藥物用于臨床治療2型糖尿病已有50多年歷史，2005年EVANS等［9］通過對蘇格蘭地區(qū)31萬人的數據進行分析發(fā)現，與使用其他藥物治療的2型糖尿病患者相比，使用二甲雙胍治療的2型糖尿病患者癌癥發(fā)病率下降23%，此后二甲雙胍的抗腫瘤作用引起了研究者的重視，目前已經證實，二甲雙胍對乳腺癌、子宮內膜癌等多種惡性腫瘤具有不同程度的抗癌作用［10-11］。潘永紅等［12］報道，二甲雙胍可增強吉非替尼對體外培養(yǎng)的EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥非小細胞肺癌H1975細胞的抗癌效果。蔣超等［13］研究發(fā)現，二甲雙胍對肺癌A549細胞具有放療增敏作用。劉江偉等［14］亦報道，二甲雙胍對BxPC-3和AsPC-1兩種胰腺癌細胞裸鼠移植瘤具有放療增敏作用。本實驗以體外培養(yǎng)的直腸癌SW1463細胞及其裸鼠移植瘤為研究對象，從體內外兩個方面觀察二甲雙胍對直腸癌細胞的放療增敏作用，發(fā)現二甲雙胍單獨作用后可抑制SW1463細胞活力，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用隨之增強；聯合放療后亦降低了SW1463細胞的克隆形成能力及細胞存活率，提高了細胞凋亡率，同時建立裸鼠模型進一步觀察發(fā)現裸鼠移植瘤的體積和重量與DMBG組及照射組相比亦明顯變小和減輕，抑瘤率明顯提高，證實二甲雙胍對直腸癌細胞具有放療增敏作用。

放療作用的核心是利用射線殺死或破壞癌細胞，抑制其生長、繁殖和擴散，癌細胞對射線越敏感，放療效果越好。研究表明癌細胞群的細胞常處于不同的細胞增殖周期中，對射線敏感性也不一致，最敏感的是M期細胞，G2期細胞對射線的敏感性接近M期，S期細胞對射線敏感性最差，G1期次之［15］。本實驗檢測SW1463細胞周期發(fā)現，二甲雙胍聯合放療后細胞周期分布發(fā)生變化，G2/M期細胞比例明顯增加，而G0/G1期細胞比例減少，細胞周期明顯向對放療敏感的G2/M期偏移，說明二甲雙胍聯合放療改變了癌細胞周期分布。射線對癌細胞可以造成損傷，但癌細胞也可通過自身修復機制修復這些損傷從而產生放療抵抗，γ-H2AX是細胞DNA損傷斷裂后形成的磷酸化染色質核小體組蛋白，是細胞DNA損傷的標志［16］。DNA-PK是DNA依賴性蛋白激酶，是基因組DNA損傷修復過程中的關鍵蛋白激酶，參與并決定著非同源末端連接DNA損傷修復通路的整個過程［17］。本實驗進一步應用免疫印跡法檢測SW1463細胞γ-H2AX及DNA-PK蛋白的表達，發(fā)現相較單獨二甲雙胍或放療作用，二甲雙胍聯合放療后γ-H2AX蛋白表達明顯上調，而DNA-PK蛋白表達明顯下調，提示二甲雙胍聯合放療可抑制SW1463細胞DNA損傷的自我修復能力。

綜上，本實驗從體內外初步證實二甲雙胍對直腸癌細胞具有放療增敏作用，其作用機制可能是二甲雙胍聯合放療改變了腫瘤細胞周期分布，抑制了腫瘤細胞DNA放療損傷后的自我修復能力。