王 佩，段明珠，黃 貝，熊 靜，梁 英，黃文樹,2,3

(1.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心，福建 廈門 361021;3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005)

0 引言

抗菌肽(antimicrobial peptides)又稱宿主防御肽，是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要成分，廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類廣譜抗微生物活性的多肽[1-3]。殺菌/滲透性增強蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein,BPI) 是一類重要的抗菌肽，是Weiss等[4]1975年從兔子中性粒細胞中首次分離出來的，是一種可迅速殺死大腸桿菌(Escherichiacoli)的多肽。1977年，Weiss等[5]從人類的中性粒細胞中也分離得到了該抗菌肽，其 Isoelectric Point(pI)值為9.8，分子質(zhì)量為58～60 ku，當pH值達到7.0時，其殺菌和增強滲透性活性均最大，可殺死革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonellaspp.)，因此，命名為殺菌/滲透性增強蛋白。哺乳動物BPI是一類胞外蛋白質(zhì)[6]，其N端富含精氨酸和賴氨酸，以及兩個位置保守的半胱氨酸。精氨酸和賴氨酸均為陽離子氨基酸，可與含有帶負電荷的LPS結合，從而殺菌，或結合/中和內(nèi)毒素[7]。其C端和N端中間有脯氨酸富集中心連接，該區(qū)域可促進BPI 分子與LPS 結合，并介導BPI-LPS 復合物向特定宿主細胞轉運[8-9]。BPI被學者稱為未來的“超級抗生素”[10]。

除BPI外，哺乳動物的脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)也可識別LPS，二者均屬于脂質(zhì)轉移和脂多糖結合蛋白家族成員[11]。人類的LBP和BPI序列相似性高達45%，其晶體結構相似[12-13]。LBP是一種胞漿蛋白質(zhì)，與細菌脂多糖特別是類脂A高度親和[14]。在LPS刺激的炎癥反應中LBP表達量增多，且可調(diào)節(jié)LPS顆粒使其與吞噬細胞表面的CD14結合[14]。

在哺乳動物中BPI和LBP的基因序列和功能明顯不同，但是，在硬骨魚類中目前尚無法明確區(qū)分BPI和LBP[15-16]， 因此，常以BPI/LBP表示。迄今為止，已在多種硬骨魚中克隆和鑒定了BPI/LBP基因，如虹鱒(Onchorhynchusmykiss)[17]、錦鯉(Cyprinuscarpio)[18]、大西洋鱈(Gadusmorhua)[19]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[20]、香魚(Plecoglossusaltivelisaltivelis)[15]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[21]、條石鯛(Oplegnathusfasciatus)[22]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[16]和團頭魴(Megalobramaamblycephala)[23]等。與哺乳動物BPI基因主要在中性粒細胞和各種黏膜上皮細胞中表達不同，魚類BPI/LBP基因的組織表達模式較多樣。如鯉科魚類：草魚BPI在鰓中表達量最高，其次是頭腎和中腎[16]；錦鯉BPI基因在肝臟和脾臟中表達量最高[18]；團頭魴BPI/LBP基因在腎臟中表達量最高[23]。又如石鯛科魚類：條石鯛BPI-1在脾臟和肝臟中表達量最高，BPI-2在腎臟中表達量最高[22]。此外，外源刺激物刺激后，魚類BPI轉錄表達變化規(guī)律也不同。如受LPS刺激3 h后，錦鯉肝臟和頭腎中的BPI均微弱上調(diào)[18]，而受LPS刺激2 h后，團頭魴脾臟中BPI/LBP上調(diào)達到最高值[23]。

日本鰻鱺(Anguillajaponica)是我國重要的養(yǎng)殖魚類[24]。然而，細菌性疾病一直困擾著鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。迄今為止，關于鰻鱺的抗細菌免疫應答的研究較為缺乏。BPI是重要的抗細菌免疫因子，是魚類天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，目前未見鰻鱺屬BPI的相關研究?；诖耍狙芯窟\用SMARTerTMRACE技術，從日本鰻鱺中克隆、鑒定BPI基因序列，并進一步利用Real-time PCR技術，研究在正常養(yǎng)殖和人工免疫物刺激下，BPI基因在日本鰻鱺體內(nèi)表達量變化的規(guī)律，以期為闡析鰻鱺BPI/LBP基因的分類、命名及其結構功能等提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

日本鰻鱺((203±53)g)，購于福建省集美大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。于水溫(28±2)℃暫養(yǎng)1周后，采集日本鰻鱺血液、鰓、心臟、肝臟、胃、腸、脾臟、頭腎、中腎、鰾、性腺和皮膚等組織/器官用于試驗。

免疫刺激試驗： 腹腔注射，設PBS對照組、LPS刺激組(0.01 mg/g，Sigma)、Poly I:C刺激組(0.01 mg/g，Sigma)、遲緩愛德華氏菌刺激組(2×105cfu/g)，在注射后8 h、16 h、24 h和72 h采樣。每組每個時間點隨機取鰻鱺8尾。

1.2 BPI基因cDNA序列的克隆

將約100 mg日本鰻鱺肝臟組織用Trizol?Rreagent試劑盒提取其總RNA，具體操作參考相關研究[25]。用瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法(NanoDrop2000，美國Thermo)檢測所提取總RNA的完整性和純度，即RNA 的28 S和18 S條帶清晰且D260/D280為1.8～2.0時，方可用于下一步實驗。隨后，總RNA經(jīng)RNase-free DNase I(New England Biolabs Inc，美國)處理，反轉錄(SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，Clontech，美國)獲得第一鏈模板。

通過分析已制備的日本鰻鱺肝臟和腎臟cDNA文庫，獲得BPI基因的EST序列，設計引物(見表1)，進行巢式PCR擴增，獲得BPI基因的5′和3′末端cDNA序列，進一步設計引物，再經(jīng)PCR擴增，驗證其全長cDNA序列。

1.3 BPI基因組序列的擴增

取日本鰻鱺的肌肉，參照MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒(TaKaRa，日本)說明書，提取日本鰻鱺基因組DNA。根據(jù)已經(jīng)獲得的基因全長cDNA 序列設計特異性引物(見表1)，擴增BPI的基因組DNA。

1.4 Real-time PCR

取4 μg健康日本鰻鱺組織的總RNA，經(jīng)DNA酶處理及反轉錄(GoScripTMReverse Transcription System，Promega，美國)用以制備Real-time PCR模板，用RNAase free water稀釋一定倍數(shù)后保存、備用。

以β-actin為內(nèi)參基因，在 LightCycler 480 II實時定量PCR儀上進行實時檢測與分析。qPCR反應體系如下：2× LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix 10.0 μL，稀釋后的cDNA模板4.0 μL，正、反向引物 (10 μmol·L-1)各0.5 μL，PCR-Grade water 5.0 μL。反應條件：95 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，40個循環(huán)。熒光信號采集溫度為81℃。反應結束后分析產(chǎn)物的溶解曲線，判斷其特異性。以β-actin作為內(nèi)參基因，梯度稀釋已知拷貝數(shù)的AJBPI和β-actin質(zhì)粒樣品及組織/器官樣品分別進行PCR擴增，繪制標準曲線進而計算各基因的擴增效率。

1.5 生物信息學分析

利用NCBI網(wǎng)站中的Blast進行序列比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；通過ExPASy的翻譯工具獲得BPI的氨基酸序列(http://web.expasy.org/translate/)，再用ExPASy預測BPI氨基酸的分子量和pI值(http://web.expasy.org/compute_pi/)；用SignalP 4.1 Server程序分析信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；用Pfam程序分析BPI的結構域(http://pfam.xfam.org/)；利用DNAman軟件進行氨基酸序列的多重比對；應用MEAG5.0軟件，采用鄰位相接法(NJ法)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel和Spss18.0軟件進行數(shù)據(jù)計算，用單因素變量方差分析法 (ANOVA)分析LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后樣品間的表達量差異，利用 Dunnettt-Test (2-sided) 進行多重比對。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差 (SEM) 的方式表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。利用GraphPad.Prism.v5.0軟件進行作圖。

表1 引物序列

說明：直下劃線部分位于前一個外顯子，加粗波浪線的部分位于后一個外顯子

Notes:Nucleotides sequence underlined is located in the former exon，that with wavy line is located in the latter exon

2 結果

2.1 日本鰻鱺AJBPI基因序列分析

從日本鰻鱺的肝臟和腎臟cDNA文庫中篩選到兩條BPI的EST序列，通過RACE、PCR克隆和序列拼接，獲得日本鰻鱺兩條BPI的cDNA序列，分別命名為AJBPI-1和AJBPI-2。AJBPI-1 cDNA全長1617 bp，包括5′UTR 207 bp，開放閱讀框(ORF) 1278 bp(編碼425個氨基酸殘基)，3′UTR 132 bp(見圖1)，預測其前體肽分子質(zhì)量為46.26 ku，pI值為8.58。AJBPI-2 cDNA全長1911 bp，包括5′UTR 93 bp，開放閱讀框(ORF)1422 bp(編碼473個氨基酸殘基)，3′UTR 396 bp(見圖2)，預測其前體肽分子質(zhì)量為51.74 ku，pI值為10.11。通過Phyre2對抗菌肽AJBPI-1和AJBPI-2二級結構預測，結果表明二者主要由β-折疊構成，其含量分別高達53%和48%，該結構有利于AJBPI抗菌肽構象的穩(wěn)定；其次為α-螺旋，其含量分別為21%和26%。通過SWISS-MODEL預測，發(fā)現(xiàn)抗菌肽AJBPI-1和AJBPI-2的三級結構相似，即它們均有“桶狀結構單元”，該桶狀結構單元由N-和C-末端氨基酸殘基中心的β-折疊連接(見圖3)。

通過對兩種AJBPI的N端氨基酸殘基分析可知，AJBPI-1含精氨酸和賴氨酸數(shù)量分別為4和8，少于AJBPI-2(12和35)(見圖1、2和表 2)。

表2 魚類BPI的序列信息

物種Species登錄號Aaccessionno.基因Gene類型TypeN端賴氨酸個數(shù)The number oflysines atN-terminalN端精氨酸個數(shù)The number ofarginines atN-terminalpI值Isoelectricpoint與AJBPI-1的相似性或一致性/%Similaritywith AJBPI-1與AJBPI-2的相似性或一致性/%Similariwith AJBPI-2日本鰻鱺Anguilla japonica—BPI-1I488.58100/10044.70/32.70大西洋鮭Salmo salarACI33182.1BPII745.4856.47/44.4750.10/36.78條石鯛Oplegnathus fasciatusBAM21037.1BPII1044.6556.00/44.4749.47/35.94大黃魚Larimichthys croceaABO32254.1BPII1145.1351.29/40.0046.82/34.11日本鰻鱺Anguilla japonica—BPI-2II201510.1144.70/32.70100/100團頭魴Megalobrama amblycephalaAIT76553.1BPI/LBPII1648.8548.47/33.8873.78/64.40斑點叉尾Ictaluru spunctatusAAX20011.1BPI/LBPII1778.1948.7/35.5273.99/63.84錦鯉Cyprinus carpioBAC56095.1BPI/LBPII1958.8250.35/34.3574.84/65.11牙鲆Paralichthys olivaceusACV74252.1BPI/LBPII1769.5950.35/36.0073.78/64.27虹鱒Oncorhynchus mykissBAB91244.1BPI/LBP-2II1969.3450.11/36.2376.53/67.65虹鱒Oncorhynchus mykissBAB91243.1BPI/LBP-1II1499.0748.70/35.0577.58/68.71香魚Plecoglossus altivelis altivelisBAH11125.1BPI/LBPII19159.6752.00/36.2377.91/69.21胡瓜魚Osmerus mordaxACO09816.1BPIII1279.6151.29/35.5279.14/70.00條石鯛Oplegnathus fasciatusBAM21038.1BPI/LBPII231510.1849.88/35.2976.95/66.80大西洋鱈Gadus morhuaAAM52335.1BPI/LBP-1II181210.0249.41/34.1168.28/57.50大西洋鱈 Gadus morhuaAAM52336.1BPI/LBP-2II181210.0549.17/33.8868.07/57.29

從兩棲類、硬骨魚類及哺乳動物中選取代表種的BPI序列(GenBank登錄號見表3)，進行多重比對，結果顯示：所有物種BPI都具有保守的LPS結合結構域和一對位置固定的二硫鍵，以及脯氨酸富集中心結構域。序列相似性比對結果顯示，AJBPI-1序列與大西洋鮭相似性最高(56.47%)，其次為條石鯛(56.0%)；AJBPI-2序列與胡瓜魚相似性最高(79.14%)，其次為香魚(77.91% )(見表2)。利用MEAG4.0軟件構建NJ系統(tǒng)進化樹(Jones Taylor Thornton model,JTT模型)，系統(tǒng)進化樹的拓撲結構顯示：哺乳動物聚為一大支，硬骨魚類聚為另一大支。其中硬骨魚類又分為兩小支：AJBPI-1與大西洋鮭、條石鯛和大黃魚的陰離子BPI基因聚為一支；AJBPI-2與虹鱒等陽離子BPI基因聚為一支(見圖4)。

表3 其他物種的登錄號

2.2 AJBPI-1和AJBPI-2基因在不同組織中的分布

利用Real-time方法分析AJBPI-1和AJBPI-2在正常鰻鱺不同組織中的表達規(guī)律。結果顯示：二者在日本鰻鱺肝臟、腸、皮膚、心臟、血液、胃、頭腎、中腎、脾臟、鰓等組織/器官表達中均有轉錄表達，尤其是在肝臟、中腎、脾臟、頭腎、皮膚、血液中表達量較高。AJBPI-1在肝臟中轉錄表達量最高，是β-actin的0.075倍；而AJBPI-2，在頭腎和中腎中表達量較高，是β-actin的0.44倍。中腎、頭腎和血液中的AJBPI-2極顯著高于AJBPI-1(P<0.001)，而肝臟中的AJBPI-1卻極顯著高于AJBPI-2(P<0.01)(見圖5)。

2.3 免疫刺激后AJBPI-1和AJBPI-2的基因表達變化

為了研究不同刺激物刺激后對AJBPI-1和AJBPI-2基因表達情況的影響，本實驗用LPS、Poly I:C和E.tarda分別刺激日本鰻鱺。結果顯示：

脾臟中，經(jīng)Poly I:C和E.tarda刺激后，AJBPI-1的表達量均迅速達到最高值，分別為PBS對照的4.0倍和3.3倍，刺激后16 h，AJBPI-2的表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)，分別為PBS對照組的2.3倍和1.7倍。經(jīng)LPS刺激后，AJBPI-1和AJBPI-2的表達水平無顯著變化(P>0.05)(見圖6)。

鰓中，經(jīng)LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后，AJBPI-2的表達量均有上調(diào)。其中，LPS和Poly I:C刺激后24 h，AJBPI-2表達量最高，分別為PBS對照組的2.5倍和17.0倍；E.tarda刺激后18 h，AJBPI-2表達量最高，為PBS對照組的7.0倍。而該三種刺激物刺激后，AJBPI-1的表達量均無顯著變化(P>0.05)(見圖6)。

中腎中，經(jīng)LPS和Poly I:C刺激后16 h，AJBPI-1和AJBPI-2的表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)。其中，LPS刺激后，AJBPI-1和AJBPI-2分別為PBS對照組的3.0倍和2.0倍；而Poly I:C刺激后，AJBPI-1 和AJBPI-2均為PBS對照組的2.2倍。然而，E.tarda刺激后，中腎中AJBPI-2的表達量無顯著變化(P>0.05)(見圖6)。

3 討論

BPI是一類含有LPS結合結構域和脯氨酸富集區(qū)的陽離子抗菌肽。它通過LPS結合結構域與革蘭氏陰性菌的脂多糖發(fā)生結合[26]，從而發(fā)揮抗菌作用。

魚類I型BPI主要在中性粒細胞和上皮細胞中表達。如條石鯛BPI-1基因在肝臟、脾臟中高表達[22]，大黃魚BPI基因在肝臟、頭腎、心臟中高表達[21]。本研究的AJBPI-1在所檢測的各個組織中均有表達，且在肝臟、頭腎和脾臟中高表達。這表明日本鰻鱺BPI-1基因的組織分布與上述魚類BPI基因的組織分布相似。異源性抗原物質(zhì)如LPS、病毒和細菌刺激可顯著誘導魚類BPI基因的表達。如E.tarda和真鯛虹彩病毒(red sea bream iridovirus，RSIV)誘導后，條石鯛BPI-1基因在頭腎中表達量顯著上調(diào)[22]。受溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和諾卡氏菌(Nocardiaseriolae)刺激后，大黃魚頭腎、脾臟、腸道、腎臟、鰓和肌肉中BPI基因的表達量顯著上調(diào)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，用LPS、Poly I:C和E.tarda分別刺激日本鰻鱺中腎、脾臟和鰓時，中腎中AJBPI-1的表達量均有顯著上調(diào)；在Poly I:C和E.tarda刺激下脾臟中AJBPI-1的表達量具有顯著性變化，而鰓中AJBPI-1的表達量均無顯著變化。根據(jù)以上結果可知，BPI-1主要在脾臟、腎臟等造血器官中高表達。

綜上所述，本研究從日本鰻鱺中克隆、鑒定了兩類AJBPI基因。AJBPI在所檢測的組織中均有不同程度的表達，用LPS、Poly I:C和E.tarda分別刺激時日本鰻鱺中的腎、鰓和脾臟中的AJBPI均有不同響應。該研究結果顯示AJBPI可能參與日本鰻鱺的抗細菌和抗病毒免疫，而且它將為魚類的BPI/LBP基因的命名、分類及其功能分析等提供一定的理論依據(jù)。