劉慧春，李明江，金亮，田丹青，朱開元，張加強(qiáng)，周江華，譚晨

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究開發(fā)中心，浙江 杭州 311202)

印度梨形孢真菌(Piriformosporaindica)首次發(fā)現(xiàn)于印度西北部的塔爾沙漠[1]，是一種可與植物共生的真菌，其典型特征是厚垣孢子為梨形[2]。依據(jù)該真菌的形態(tài)特征和其18S rRNA序列在Genebank中的比對(duì)結(jié)果可知，該真菌在分類上屬于擔(dān)子菌門傘菌綱蠟殼耳目蠟殼耳科梨形孢屬。印度梨形孢與從枝菌根真菌在形態(tài)和生理特征上非常相似，均與植物共生，其最大差別在于，枝菌根真菌無(wú)法在人工合成的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，而印度梨形孢可在人工培養(yǎng)基上繼代繁殖[3]。

印度梨形孢可接種于多種植物根部，包括雙子葉植物擬南芥、小白菜、油菜和單子葉植物大麥、水稻、玉米、文心蘭等[4-10]。印度梨形孢與植物產(chǎn)生共生關(guān)系后，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加植物生物量，植株抗氧化能力增強(qiáng)，并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等[11-13]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，大麥感染印度梨形孢真菌后，生長(zhǎng)素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，印度梨形孢可能通過生長(zhǎng)素的合成、運(yùn)輸調(diào)節(jié)植物地上部生長(zhǎng)和根發(fā)育[14]。

本研究將印度梨形孢應(yīng)用于觀賞植物文心蘭(Oncidiumorchid)中，建立了有效的印度梨形孢和文心蘭的接種系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)印度梨形孢菌絲可以穿入文心蘭根部的表皮層細(xì)胞，促進(jìn)根部的生長(zhǎng)和加粗，對(duì)文心蘭地上部生長(zhǎng)也有明顯的促進(jìn)作用。

1 材料方法

1.1 供試材料

供試材料為文心蘭切花品種南西，生長(zhǎng)于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開發(fā)中心組培室中；供試印度梨形孢菌株由臺(tái)灣大學(xué)葉開溫教授惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)方法

文心蘭。在組培瓶中采用1/2MS培養(yǎng)基無(wú)菌培養(yǎng)文心蘭小苗，待小苗高3～5 cm，有1～3個(gè)根時(shí)接入改良的G10培養(yǎng)基(1 L溶液中含有MS粉3.46 g，馬鈴薯200 g，瓊脂10 g，蔗糖20 g，pH值5.7～5.8)培養(yǎng)2周。培養(yǎng)條件為20～28 ℃光照培養(yǎng)16 h，18～23 ℃黑暗培養(yǎng)8 h。

印度梨形孢。將印度梨形孢菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基(1 L溶液中含有馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 15 g)上，石蠟?zāi)し饪冢?8 ℃黑暗培養(yǎng)1周后備用。

共培養(yǎng)。將上述培養(yǎng)好的印度梨形孢菌塊接種于文心蘭組培瓶中，距離文心蘭根部0.5～2 cm，培養(yǎng)條件為20～28 ℃光照培養(yǎng)16 h，18～23 ℃黑暗培養(yǎng)8 h。

共培養(yǎng)20 d左右更換培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)中不需要再加入菌塊，文心蘭根部攜帶的真菌可作為菌種進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.3 石蠟切片觀察

根解剖結(jié)構(gòu)的觀察參照李正理[15]石蠟切片法。

2 結(jié)果與分析

2.1 共培養(yǎng)體系的建立

供試材料文心蘭切花品種南西的組織培養(yǎng)生根小苗所用培養(yǎng)基為1/2MS，印度梨形孢繼代培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。通過前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將印度梨形孢接入1/2MS后，真菌生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)5 d后仍未見明顯生長(zhǎng)。為建立印度梨形孢與文心蘭的共培養(yǎng)體系，對(duì)文心蘭所用1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行改良，加入馬鈴薯汁形成G10培養(yǎng)基，觀察文心蘭和真菌在此培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，文心蘭在G10培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育正常；印度梨形孢在G10培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)速度與在PDA培養(yǎng)基上接近，菌絲和孢子均生長(zhǎng)正常(圖1)。

把文心蘭組織培養(yǎng)小苗接入G10培養(yǎng)基，生長(zhǎng)約2周后，用印度梨形孢菌絲塊接種文心蘭小苗，菌塊放置于根部約0.5 cm處，進(jìn)行真菌和幼苗的共培養(yǎng)。約20 d后，印度梨形孢真菌可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。此時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)的文心蘭植株開始萌發(fā)新的氣生根，且比侵染前的根要粗壯。為避免菌絲的過量生長(zhǎng)對(duì)植物生長(zhǎng)帶來(lái)抑制，在共培養(yǎng)20 d后，將共培養(yǎng)和對(duì)照植株均接入新的G10培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)的植株不再接入新的菌塊，根部攜帶的真菌可在20 d左右鋪滿新的培養(yǎng)基，達(dá)到共培養(yǎng)的目的。

2.2 印度梨形孢對(duì)文心蘭根部的侵染

為檢測(cè)印度梨形孢對(duì)文心蘭根部的侵染狀況，對(duì)印度梨形孢共培養(yǎng)植株的根做了石蠟切片。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢可定殖于文心蘭的根部。從圖2可以看出，印度梨形孢菌絲可以成功侵入文心蘭根部的表皮層，并在表皮細(xì)胞內(nèi)部延伸擴(kuò)展。從圖3可以看出，印度梨形孢的侵染和在根部的定殖造成了文心蘭根部表皮層細(xì)胞的膨大，由于這層細(xì)胞的膨大造成了共培養(yǎng)植株根的加粗。

圖1 印度梨形孢在G10和PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后的生長(zhǎng)狀況

RC，表皮層。20×、40×、100×代表顯微鏡不同倍數(shù)；CC，維管柱；C，皮層；RC，表皮層圖2 印度梨形孢菌絲對(duì)植株根部表皮層的侵染狀況

CC，維管柱；C，皮層；RC，表皮層圖3 印度梨形孢共培養(yǎng)植株和對(duì)照植株的根縱切面比較

2.3 印度梨形孢對(duì)文心蘭的促生作用

共培養(yǎng)50 d后，將對(duì)照植株和共培養(yǎng)植株出瓶，對(duì)共培養(yǎng)植株和對(duì)照植株的生物量進(jìn)行觀察和測(cè)定。從圖4可以看出，印度梨形孢共培養(yǎng)對(duì)文心蘭植株的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，株高、根的數(shù)量上明顯高于對(duì)照；從表1可以看出，共培養(yǎng)植株的株高比對(duì)照增加70%左右，鮮重增加96%左右。共培養(yǎng)植株的根的數(shù)量明顯增加，根總長(zhǎng)度是對(duì)照的2.4倍。

圖4 印度梨形孢共培養(yǎng)植株的表型觀察

表1 印度梨形孢共培養(yǎng)植株的生長(zhǎng)促進(jìn)狀況

3 討論

真菌培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基有PDA、CZA等，植物組織培養(yǎng)多用MS、1/2MS培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基的分離真菌效果不同[16-17]。在本研究中，印度梨形孢真菌在1/2MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，但在加有土豆的G10培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)就能像在PDA真菌培養(yǎng)基中一樣正常。這可能源于印度梨形孢是寄生菌，需要從寄主植物吸收營(yíng)養(yǎng)元素才能更好地生長(zhǎng)，加有土豆的培養(yǎng)基剛好可以提供印度梨形孢所需的營(yíng)養(yǎng)元素。1/2MS培養(yǎng)基中主要成分是碳源和糖，不能有效供給印度梨形孢所需的營(yíng)養(yǎng)需求，所以生長(zhǎng)緩慢。

本研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢可很好地與文心蘭共生，其菌絲定殖在文心蘭根部表皮層，并通過表皮細(xì)胞的擴(kuò)增使得根部加粗，這一現(xiàn)象非常符合印度梨形孢的特性，即印度梨形孢與植物共生后菌絲僅在根系表面、根系表皮細(xì)胞之間和根系表皮細(xì)胞內(nèi)部擴(kuò)展[18]。據(jù)報(bào)道，印度梨形孢不僅能夠與多數(shù)植物共生[19]，而且還能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，這可能與赤霉素有關(guān)[10,14]。印度梨形孢定殖于寄主植物根部，通過分泌生長(zhǎng)素來(lái)促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)，從而加快根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，最終達(dá)到對(duì)寄主植物的促生作用[20-25]。由此推測(cè)，印度梨形孢對(duì)文心蘭的促生作用，與印度梨形孢感染文心蘭后提高了寄主植物根系赤霉素的含量有關(guān)。

綜上所述，印度梨形孢可與文心蘭共生，菌絲定殖于文心蘭根部表皮層，能提高根系的數(shù)量和長(zhǎng)度，促進(jìn)文心蘭植株地上部分的生長(zhǎng)。后續(xù)有待進(jìn)一步研究印度梨形孢對(duì)文心蘭的促生、抗逆作用，并有望將印度梨形孢應(yīng)用于文心蘭組培苗煉苗、種苗繁育、栽培、育種等方面。