薛 啟 王康才 梁永富 隋 利 易家寧

(1 南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095； 2 上海市藥材有限公司，上海 200002)

微量元素鐵(Fe)和鋅(Zn)是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，廣泛參與植物的多種生理代謝，又是多種酶的組成成分或催化劑，對植物生長發(fā)育起著重要的調節(jié)作用。鐵在植物體內參與葉綠素的合成、體內氧化還原反應及植物的呼吸作用，作為固氮酶的活性中心，還參與許多酶促反應，兼有結構成分和活化劑的作用[1]。鋅則是葉綠素生物合成的必需元素[2]，對植物光合作用和碳水化合物代謝都有重要影響。鐵鋅配施通過改善光合作用、增加生物量調控作物體內鐵鋅平衡，其對水稻[3]、小麥[4]、豌豆[5]、枸杞[6]和苜蓿[7]等作物的生長和品質的促進效應已被證實。大量研究表明，適量施用鐵鋅肥可以提高作物抗逆性和作物產量，改善品質，但過量施用會產生毒害作用。

藿香(Agastacherugosa)為唇形科藿香屬植物，味辛，性溫，具有芳香化濕、開胃止嘔、發(fā)表解暑等功效。在我國各地均有分布，多為栽培，以全草入藥[8]。藿香次生代謝產物揮發(fā)油作為藿香主要的有效成分，廣泛應用于醫(yī)藥、化妝品、食品加工和日用品等。芳香植物的揮發(fā)油含量和成分受遺傳和外界環(huán)境條件的影響。研究表明，葉面噴施鐵鋅肥能夠增加薄荷的生物量，提高揮發(fā)油產量和質量[9]。目前，國內有關微肥對揮發(fā)油產量和成分的影響尚鮮見報道，國外對洋甘菊[10]、芫荽[11]、百里香[12]、香蜂花[13]的研究表明，鐵鋅配施可以通過影響植物生長和發(fā)育對揮發(fā)油含量產生間接影響，還能夠直接影響揮發(fā)油的含量和成分。本試驗采用大田試驗，研究鐵、鋅不同濃度配施對藿香生長發(fā)育及有效成分的影響，以期為藿香優(yōu)質高產栽培技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2017年5-9月在南京農業(yè)大學中藥材研究所溫室大棚內進行。供試土壤pH值6.84。2017年4月測定0～20 cm土壤肥力狀況為有機質54.7 g·kg-1、全氮1.65 g·kg-1、速效磷39.8 mg·kg-1、速效鉀124 mg·kg-1、有效鐵23.38 mg·kg-1、有效鋅1.25 mg·kg-1。藿香全生育期內南京市5-9月平均最高溫度29.2℃，平均最低溫度21.8℃，平均降水量為125.9～223.2 mm，平均總日照時數為161.0～218.2 h。

1.2 供試材料

藿香種子均采自河南商丘，經南京農業(yè)大學王康才教授鑒定為唇形科植物藿香(Agastacherugosa)的種子。

1.3 試驗設計

試驗采用雙因素隨機區(qū)組設計，分別為葉面噴施鐵肥量和鋅肥量。供試鐵肥為硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，鐵處理設3個水平，分別為0(Fe0)、0.2%(Fe1)和0.4%(Fe2)；鋅肥為硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)，鋅處理設3個水平，分別為0(Zn0)、0.1%(Zn1)、0.2%(Zn2)；共計9個處理，即Fe0Zn0、Fe0Zn1、Fe0Zn2、Fe1Zn0、Fe1Zn1、Fe1Zn2、Fe2Zn0、Fe2Zn1、Fe2Zn2，每個處理重復3次，共計27個小區(qū)。采用隨機區(qū)組排列，每個小區(qū)面積為1.5 m2(1.0 m×1.5 m)，各小區(qū)間有0.5 m隔離帶，每小區(qū)定植100株。試驗播種日期為2017年4月15日，待出苗后約10 cm時進行間苗，株距10 cm，行距15 cm。2017年7月14日，開始第1次噴施，此后每隔7 d噴施1次，每次噴施1 L，共噴施3次。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 藿香生物量的測定 2017年8月15日測定生理指標和光合生理參數。8月29日藿香盛花期采收地上部分，全生育期132 d，采收后每個處理隨機采樣5株，統(tǒng)計株高、莖粗、比葉面積，采收后于室內陰干至恒重，稱重，測定產量。

1.4.2 藿香生理指標測定 參照李合生[14]的方法，測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性，以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)、可溶性蛋白、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量；參照高俊鳳[15]的方法，測定淀粉、還原糖和可溶性糖含量；參照王學奎[16]的方法，采用活體法測定硝酸還原酶活性；谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和谷氨酸合酶(glutamate synthase，GOGAT)利用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒測定；總黃酮含量采用鋁鹽比色法[17]測定。

1.4.3 藿香揮發(fā)油含量測定 參照《中國藥典》2015年版[18]提取揮發(fā)油。

1.4.4 藿香葉片光合色素與光合生理參數的測定 光合色素含量參照李合生[14]的方法進行測定；光合參數利用Li-6400便攜式光合儀(美國Li-COR公司)進行測定，包括凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、氣孔導度(stomatal conductance，Gs)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)和蒸騰速率(transpiration rate，Tr)，具體操作參照李柯妮等[19]的方法。每個處理隨機選擇5株，重復3次，取其平均值。

1.4.5 礦質元素含量測定 采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法(ICP-AES)測定藿香各部位粉末中的元素含量。

1.4.6 藿香化學成分測定 參照蘇蕓蕓等[17]的方法測定藿香中的化學成分。GC-MS色譜條件：色譜柱為30 m×0.25 mm×0.25 μm HP-5石英毛細管柱，進樣溫度280℃，初始溫度60℃，以5℃·min-1升至260℃，載氣為高純氦氣，分流比100∶1，進樣量1 μL。質譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；離子源溫度200℃；檢測電壓0.8 Ke；掃描范圍40～450 amu。定性分析根據各色譜峰對應的質譜圖經氣相色譜-質譜聯用儀的計算機譜庫檢索進行定性，質譜數據庫為NIST05譜庫。各組分的相對含量根據總離子流圖由計算機采用峰面積歸一化進行計算。

1.5 數據處理

采用 Microsoft Excel 2007 進行數據預處理和作圖；SPSS 20.0對不同水平處理進行單因素方差分析，并用最小顯著差異法(LSD)檢驗數據差異性(α=0.05)，Duncan′s 進行多重比較和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 鐵、鋅配施對藿香生長發(fā)育和產量的影響

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different small letters mean significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.圖1 鐵鋅配施對藿香抗氧化酶活性及MDA含量的影響Fig.1 Effect of iron and zinc application on the antioxidant enzyme activity and the content of MDA of A.rugosa

2.1.1 鐵、鋅配施對藿香抗氧化酶活性及MDA含量的影響 由圖1可知，藿香葉片中SOD活性在Fe1Zn1處理時達到最大值，且顯著高于對照(Fe0Zn0)和Fe1Zn0處理，但與Fe0Zn1、Fe0Zn2、Fe1Zn2、Fe2Zn0、Fe2Zn1、Fe2Zn2處理均無顯著影響。POD活性在Fe2Zn1處理時達到最大值，且顯著高于其他處理。CAT活性在Fe2Zn0處理下達到最大值，且顯著高于其他處理。藿香葉片中MDA含量在Fe2Zn0處理時達到最大值，其次是Fe0Zn2和Fe2Zn2，分別較對照(Fe0Zn0)提高了47.19%、42.70%和29.89%。結果表明，施用高濃度鐵鋅處理(0.4%鐵和0.2%鋅組合)較低濃度鐵鋅處理(0.2%鐵和0.1%鋅組合)能明顯提高葉片的抗氧化酶活性，同時提高MDA含量，這可能是由于高濃度鐵鋅處理對藿香產生了一定的脅迫作用，啟動了藿香體內的抗氧化系統(tǒng)，同時增加了MDA含量以抵御脅迫作用。

2.1.2 鐵、鋅配施對藿香淀粉、還原糖、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響 由表1可知，Fe1Zn1處理的淀粉和可溶性蛋白含量均達到最大值，且顯著高于對照(Fe0Zn0)。藿香葉片中淀粉含量在Fe1Zn1處理時達到最大值(0.47%)，其次是Fe0Zn2和Fe1Zn2處理，分別較對照(Fe0Zn0)提高了46.88%、43.75%和34.38%。還原糖含量在Fe0Zn2和Fe1Zn2處理時達到最大值?？扇苄蕴呛吭贔e0Zn2和Fe2Zn1處理時達到最大值。Fe1Zn0、Fe1Zn1和Fe1Zn2處理之間的還原糖和可溶性糖含量均無顯著影響。

表1 鐵鋅配施對藿香淀粉、還原糖、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響Table 1 Effect of iron and zinc application on the content of starch, reducing sugar, soluble sugar and soluble protein of A.rugosa

2.1.3 鐵、鋅配施對藿香硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及氮代謝相關酶活性的影響 由表2可知，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均在Fe1Zn1處理時達到最大值，而Fe0Zn2、Fe1Zn0、Fe1Zn2、Fe2Zn0、Fe2Zn1、Fe2Zn2處理之間對銨態(tài)氮含量均無顯著影響，但均顯著高于對照(Fe0Zn0)。Fe1Zn2處理下的硝酸還原酶活性最強，為5.78 μg·g-1·h-1，其次是Fe1Zn1和Fe2Zn1。GS和GOGAT活性均在Fe1Zn1處理下達到最大值，且顯著高于其他處理。

表2 鐵、鋅配施對藿香硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及氮代謝相關酶活性的影響Table 2 Effect of iron and zinc application on nitrate, ammonium nitrogen content and nitrogen metabolism related enzymes activity of A.rugosa

2.1.4 鐵、鋅配施對藿香生長和產量的影響 由表3可知，不同鐵鋅配施處理對藿香生物量均具有顯著影響。其中，Fe1Zn1處理下，株高、莖粗、總黃酮含量和揮發(fā)油含量的增幅均為最大，而比葉面積在Fe1Zn2處理下達到最大值，在Fe2Zn2處理時最小。揮發(fā)油含量在Fe1Zn1處理下為0.46%，較對照(Fe0Zn0)提高了43.75%，其次是Fe1Zn2和Fe2Zn1。在Fe1Zn1處理下，藿香產量達到最高，為631.53 g，且顯著高于其他處理。結果表明，葉面施鐵對產量的影響大于葉面施鋅，但隨著施鐵濃度的增加，產量有所減少，說明過高濃度的葉面施鐵會抑制產量的增加。

表3 鐵、鋅配施對藿香生長和產量的影響Table 3 Effect of iron and zinc application on growth and yield of A.rugosa

2.2 鐵、鋅配施對藿香光合特性的影響

由表4可知，不同鐵、鋅配施處理對藿香葉片中葉綠素a、葉綠素 b、類胡蘿卜素含量和葉綠素總量均有較大影響，且各噴施處理均高于對照，不同噴施處理間的光合色素含量存在差異。葉綠素a含量在Fe1Zn1處理下達到最大值，其次是Fe1Zn2和Fe2Zn0。葉綠素b含量和葉綠素總量均在Fe2Zn0處理下達到最大值。葉綠素a/b和類胡蘿卜素含量均在Fe1Zn1處理下達到最大值，分別為3.23和0.16 mg·g-1。

表4 鐵、鋅配施對藿香光合色素含量的影響Table 4 Effect of iron and zinc on the content of photosynthetic pigments of A.rugosa

由表5可知，不同鐵、鋅配施處理對藿香葉片凈光合速率、氣孔導度、胞間 CO2濃度和蒸騰速率均有顯著影響。葉片的凈光合速率在Fe1Zn1處理下達到最大值，為8.50 μmol·m-2·s-1，其次是Fe1Zn2和Fe0Zn2，分別為7.48和7.20 μmol·m-2·s-1。氣孔導度和胞間 CO2濃度均在Fe1Zn0處理下達到最大值，較對照(Fe0Zn0)分別提高116.67%和18.05%。蒸騰速率在Fe1Zn1處理下達到最大值，為3.95 mmol·m-2·s-1。

表5 鐵、鋅配施對藿香光合參數的影響Table 5 Effect of iron and zinc application on photosynthetic parameters of A.rugosa

2.3 鐵、鋅配施對藿香礦質元素含量的影響

由表6可知，不同鐵鋅配施處理下，微量元素P、K、Zn、Fe、Mn、Mg、Ca、Cu在藿香不同部位間含量差異較大，同種元素在不同處理間的含量也存在顯著性差異。其中P和Ca在不同部位的含量均呈葉>莖>根的變化趨勢，而Mn、Mg和Cu在不同部位的含量呈根>葉>莖的變化趨勢。隨著鋅濃度的增加，在低鐵水平下(Fe1水平)，Fe1Zn0、Fe1Zn1、Fe1Zn2處理下葉片中的Ca含量呈下降趨勢；在高鐵水平下(Fe2水平)，Fe2Zn0、Fe2Zn1、Fe2Zn2處理的葉片中Ca含量均呈上升的趨勢，這可能是由于高濃度的葉面施鐵有助于葉片Ca含量的積累[20]。

表6 鐵鋅配施對藿香礦質元素含量的影響Table 6 Effect of iron and zinc application on the content of mineral elements of A.rugosa /(mg·g-1)

由圖2可知，葉面施用鋅肥和鐵肥對藿香不同部位鋅鐵含量均有較大影響，施用鋅鐵肥能夠增加藿香各部位的鐵鋅含量，其中鋅在不同部位的含量呈葉>根>莖的變化趨勢，而鐵在不同部位的含量呈根>葉>莖的變化趨勢，鋅主要集中在藿香葉片，而鐵則主要集中在藿香根部。未施鋅處理(Fe0Zn0、Fe1Zn0、Fe2Zn0)葉片內鋅含量顯著低于其他處理，說明葉面噴施鋅肥是提高葉片內鋅含量的有效措施。在低鋅水平下(Zn1水平)，施用鐵肥(Fe0Zn1、Fe1Zn1、Fe2Zn1處理)的葉片內鋅含量無顯著提高(P>0.05)，在低鐵水平下(Fe1水平)，施用鋅肥(Fe1Zn0、Fe1Zn1、Fe1Zn2處理)顯著增加了根部的鐵含量(P<0.05)，這可能與鐵鋅的相互作用及共用轉運蛋白有關[21]。

圖2 鐵、鋅配施對藿香不同部位鐵鋅含量的影響Fig.2 Effect of iron and zinc application on the content of iron and zinc in different parts of A.rugosa

2.4 鐵、鋅配施對藿香主要化學成分的影響

由表7可知，不同噴施處理下，藿香主要化學成分含量存在差異。其中，D-檸檬烯含量最高，且在Fe1Zn2處理下達到最大值，其次是Fe1Zn1和Fe2Zn1。比較單獨葉面施用鋅肥(Fe0Zn0、Fe0Zn1、Fe0Zn2)和單獨葉面施用鐵肥(Fe0Zn0、Fe1Zn0、Fe2Zn0)可知，隨著施鋅和施鐵濃度的增加，D-檸檬烯、L-薄荷酮和胡薄荷酮含量均呈先升高后降低的趨勢，說明一定的葉面施鋅和施鐵濃度，能提高藿香主要化學成分的含量，但過高濃度的施用則起到抑制作用。胡薄荷酮含量在Fe1Zn1處理下達到最大值，胡椒酚甲醚和氧化石竹烯含量均在Fe1Zn2處理下達到最大值，而桉油烯醇含量在Fe2Zn1處理下最高。

表7 鐵、鋅配施對藿香主要化學成分的影響Table 7 Effect of iron and zinc on the main chemical composition of A.rugosa /%

3 討論

3.1 鐵鋅配施對藿香生長及養(yǎng)分吸收的影響

合理的鐵鋅配施能通過參與植物光合作用等一系列生理生化過程，影響作物產量和品質[22]。研究發(fā)現適當的供鋅處理能有效促進玉米幼苗的生長，提高植株的光合特性[23]。付力成等[24]認為，葉面鋅鐵配施能夠延長葉片有效功能期，增強光合作用以及促進結實期營養(yǎng)物質向籽粒的運輸，從而提高水稻千粒重和結實率。Galavi等[25]研究表明，葉面噴施鐵鋅肥能明顯增加紅花(Carthamustinctorius)植株的生物量、種子產量、千粒重以及種子含油量，并指出增產的機制可能是鐵和鋅的配施增強了紅花的光合作用，同時促進根系的生長及對多種酶的攝取。Mohamed等[26]研究鐵鋅配施對蠶豆(ViciafabaL.)生長的影響，發(fā)現葉面鐵鋅配施引起了復雜的生理生化反應，猜測反應是由于鐵或鋅在植物體內參與合成了新的蛋白質，從而導致mRNA翻譯或RNA轉錄變化引起的。這與本研究結果基本相似。本研究發(fā)現鐵鋅配施能顯著影響藿香的抗氧化酶活性，并顯著提高淀粉、還原糖、可溶性糖和可溶性蛋白含量，通過影響氮代謝相關酶活性間接影響植株氮代謝過程。鐵和鋅參與葉綠素的生物合成，鐵鋅配施通過調控光合色素含量和光合參數來影響藿香光合作用，從而增加光合產物積累，影響藿香的產量和揮發(fā)油成分。綜合考慮藿香的生長和產量指標，認為Fe1Zn1為鐵鋅配施的最優(yōu)處理組合。

3.2 鐵鋅配施對藿香各部位鐵鋅分配及礦質元素吸收的影響

付力成等[24]對水稻葉面噴施鋅鐵肥，發(fā)現水稻吸收鋅主要積累在莖、穗、葉、葉鞘等部位。王衍安等[27]研究鐵鋅互作對蘋果鋅、鐵吸收分配的影響，指出根部鋅濃度顯著高于枝和葉，認為當環(huán)境中鋅過量時，植物體可能主動將鋅儲存于液泡中以減小鋅的毒害；當環(huán)境鋅不足時，優(yōu)先滿足地上部分的鋅需求。這種對鋅積累的差異，可能是由物種差異引起的。本研究中，施用鋅鐵肥能夠增加藿香各部位的鐵鋅含量，鋅在不同部位的含量呈葉>根>莖的變化趨勢，鐵在不同部位的含量呈根>葉>莖的變化趨勢，鋅主要集中在藿香葉片，而鐵則主要集中在藿香根部。研究發(fā)現大多數植物體內鐵含量為50～150 mg·kg-1，鋅含量為10～100 mg·kg-1[28]，而本試驗中，藿香鐵鋅含量較正常值偏大，但并未表現出明顯的毒害作用，這可能與物種差異有關，也可能是由于藿香是耐鐵鋅植物或鐵鋅間的相互作用引起的，具體原因還有待進一步研究。目前，關于鐵鋅之間的相互作用已有大量報道。鐵與鋅具有共同的轉運蛋白如IRT1和IRT2等[29]，高鋅毒害會引起植物葉片類似于缺鐵失綠癥[30]，而Rosen等[31]研究認為這與葉片鐵濃度的降低無關，可能是鐵鋅的交互作用抑制了鐵的功能。王衍安等[27]研究發(fā)現鐵鋅在蘋果根部表現協(xié)同作用，鋅促進了鐵在根系的累積，高鐵對緩解鋅的毒害起到了一定的平衡作用。本研究中，在低鋅水平下(0.1%Zn)，葉面鐵肥的施用顯著提高了葉片內鋅含量，而低鐵水平下(0.2%Fe)，施用鋅肥則顯著增加了根部的鐵含量，這可能與鐵鋅的相互作用及共用轉運蛋白有關，具體機理還有待進一步研究。此外，本研究還發(fā)現一定濃度的鐵鋅配施有助于藿香對其他微量元素的吸收。在低鐵水平下(0.2%Fe)，隨著鋅濃度的增加，Ca含量呈下降的趨勢，但在高鐵水平下(0.4%Fe)，隨著鋅濃度的增加，Ca含量呈上升的趨勢，這可能是由于高濃度的葉面施鐵有助于葉片Ca含量的累積。

3.3 鐵鋅配施對藿香揮發(fā)油含量的影響

揮發(fā)油作為藿香的主要有效成分，其含量和品質是藿香生產中的重要指標。Zehtab等[32]報道，葉面噴施微量元素鐵和鋅對薄荷葉精油率和精油產量均有顯著影響。Nasiri等[33]研究發(fā)現，適量的鐵鋅配施能顯著提高洋甘菊(MatricariachamomillaL.)的產量、精油率和精油產量，鐵鋅配施較單獨施用鐵和鋅效果更好，其精油含量較對照提高了81.77%。Said-Al等[34]研究鹽脅迫條件下鐵鋅單獨及復合噴施對羅勒(OcimumbasilicumL.)產量及精油含量的影響，發(fā)現在無脅迫條件下鐵鋅配施能使產量和精油含量達到最大值，鑒定出芳樟醇和甲基胡椒酚是其精油的主要成分，鹽脅迫條件下鐵鋅配施芳樟醇含量最高，無脅迫條件下施鋅或鐵鋅配施甲基胡椒酚含量最高。Said-Al等[11]研究鋅和鐵對芫荽(CoriandrumsativumL.)3個發(fā)育階段植株生長、精油和化學成分的影響，發(fā)現在營養(yǎng)生長和開花階段400 ppm鋅和200 ppm鐵配施對產量和精油含量影響最大，同時不同的鐵鋅濃度能顯著影響芫荽的精油含量和精油成分。本研究結果表明，隨著施鋅和施鐵濃度的增加，D-檸檬烯、L-薄荷酮和胡薄荷酮含量均呈先升高后降低的趨勢，說明一定的葉面施鋅和施鐵濃度，能提高藿香主要化學成分的含量，但過高濃度的施用則起到抑制作用。鐵鋅配施對藿香揮發(fā)油含量和成分均有顯著影響，但其作用機理還有待進一步研究。

4 結論

葉面噴施鐵鋅肥能顯著影響藿香的生長發(fā)育、產量和揮發(fā)油成分。Fe1Zn1(0.2%Fe，0.1%Zn)為鐵鋅配施的最優(yōu)處理組合，施用鋅鐵肥能夠增加藿香各部位的鐵鋅含量，鋅主要集中在藿香葉片，而鐵則主要集中在藿香根部。高濃度的葉面施鐵有助于葉片Ca含量的累積。微量元素在植物體內參與復雜的生理生化過程，有關鐵鋅在藿香體內的轉運機理和鐵鋅影響揮發(fā)油成分的機理還有待進一步研究。