羅 梅 董章勇,* 林進(jìn)添 林桂文

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225)

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種廣泛應(yīng)用的生防菌，據(jù)報(bào)道已有超過700個(gè)物種是其適合的寄主[1-3]。目前我國主要利用球孢白僵菌對(duì)馬尾松毛蟲(DendrolimuspunctatusWalker)、玉米螟(Ostriniafurnacalis)等林業(yè)及大田害蟲進(jìn)行防治[4-8]。盡管球孢白僵菌應(yīng)用廣泛，但生產(chǎn)上仍存在球孢白僵菌防治效果慢、不同菌株胞外水解酶的種類和表達(dá)水平的差異、易受環(huán)境影響等缺點(diǎn)[3-4]。因此，研究球孢白僵菌的致病機(jī)理有助于進(jìn)一步挖掘其應(yīng)用潛能。

效應(yīng)子(effector)也稱效應(yīng)因子或效應(yīng)蛋白，廣義上是指能夠選擇性地結(jié)合其他目標(biāo)蛋白及調(diào)節(jié)其生物活性的一類小分子蛋白[9-11]。隨著對(duì)植物病原菌的深入研究，效應(yīng)子已經(jīng)成為研究病原菌與寄主互作的重要內(nèi)容[9-12]。根據(jù)病原菌效應(yīng)分子保守基序(motif)的特點(diǎn)，大部分效應(yīng)分子都屬于分泌蛋白[13]。諸多研究者綜合已有的效應(yīng)子的特征總結(jié)出以下具體分析指標(biāo)[14-16]：含有N-端信號(hào)肽；無跨膜結(jié)構(gòu)域；無糖基磷脂酰肌醇錨定位點(diǎn)；沒有將蛋白輸送至線粒體或其他胞內(nèi)細(xì)胞器的預(yù)測(cè)定位信號(hào)；氨基酸殘基數(shù)量大約為50～300個(gè)氨基酸；富含半胱氨酸；序列具有高度特異性。隨著生物信息學(xué)和基因組學(xué)的快速發(fā)展，也有研究者應(yīng)用生物信息學(xué)軟件的方法對(duì)效應(yīng)子的結(jié)果進(jìn)行了預(yù)測(cè)[17-26]。通過高通量的方法篩選，雖然可能會(huì)遺漏部分效應(yīng)子，但可以極大地縮小研究范圍。如Dong等[27]對(duì)球孢白僵菌激活埃及伊蚊(Aedesaegypti)的Toll和JAK-STAT信號(hào)通路以調(diào)制效應(yīng)蛋白和抵抗登革熱；Cen等[28]研究表明，球孢白僵菌效應(yīng)子LysM通過破壞昆蟲的免疫反應(yīng)而起到防治作用。目前球孢白僵菌基因組測(cè)序雖已完成[8]，通過基因組序列高通量篩選致病因子也提供了數(shù)據(jù)來源，但尚未見基于基因組信息高通量篩選球孢白僵菌的效應(yīng)子的報(bào)道。

本研究基于已公布的球孢白僵菌全基因組信息，根據(jù)效應(yīng)分子典型特征，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其候選效應(yīng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行初步分析，以期為球孢白僵菌效應(yīng)子的進(jìn)一步篩選與驗(yàn)證提供理論依據(jù)，并為探究效應(yīng)子在昆蟲與病原菌互作過程中的作用奠定基礎(chǔ)，為球孢白僵菌的防治應(yīng)用提供新的依據(jù)和途徑。

1 材料與方法

1.1 基因組信息

球孢白僵菌蛋白序列在NCBI(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/280/675/GCF_000280675.1_ASM28067v1/GCF_000280675.1_ASM28067v1_protein.faa.gz)上下載。球孢白僵菌基因組共包含10 364個(gè)蛋白序列。

1.2 分泌組蛋白預(yù)測(cè)及分析

通過SignalP v4.1分析10 364個(gè)蛋白序列，然后利用TMHMM v2.0對(duì)有信號(hào)肽的蛋白進(jìn)行分析，選取跨膜結(jié)構(gòu)域小于2的蛋白并用TargetP v1.1進(jìn)一步分析，隨后采用ProtComp v9.0分析定位在胞外的蛋白用。最后對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行序列長度統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 分泌組蛋白的胞外酶數(shù)據(jù)庫分析

將1.2分析結(jié)果與The CAZymes Analysis Toolkit (CAT)軟件包進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 分泌組蛋白的半胱氨酸含量和多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列分析

對(duì)1.2分析結(jié)果的蛋白序列的半胱氨酸含量及多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列(multiple tandem repeats)進(jìn)行分析。半胱氨酸含量采用perl工具進(jìn)行計(jì)算。將具有高半胱氨酸含量(≥ 6) 的蛋白序列進(jìn)行多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列分析。多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列采用T-Reks (http://bioinfo.montp.cnrs.fr/?r=t-reks/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 病原寄主互作數(shù)據(jù)庫分析

將1.5所獲得的蛋白序列和PHI(Pathogen-Host Interaction database)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

1.6 候選致病相關(guān)效應(yīng)因子的確定

一般的效應(yīng)因子都是小分子蛋白，因此，將1.6獲得的蛋白序列進(jìn)行長度篩選，去除大于300個(gè)氨基酸的蛋白序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 分泌組蛋白預(yù)測(cè)

對(duì)10 364個(gè)蛋白序列進(jìn)行SignalP v4.1分析，共得到1 116個(gè)具有信號(hào)肽的蛋白。采用TMHMM v2.0進(jìn)一步分析顯示，跨膜結(jié)構(gòu)域<2的共有1 041個(gè)蛋白，用TargetP v1.1進(jìn)行定位分析，共得到1 015個(gè)胞外表達(dá)蛋白，再用ProtComp v9.0進(jìn)一步分析，得到940個(gè)分泌蛋白。

2.2 分泌組蛋白序列分析

將940個(gè)蛋白進(jìn)行氨基酸殘基序列特征分析，獲得序列長度統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(perl程序)。<300個(gè)氨基酸的序列有397個(gè)，占42%；300～599個(gè)氨基酸之間的序列有394個(gè)，占42%；600～999個(gè)氨基酸之間的序列有126個(gè)，占13%；1 000～2 000個(gè)氨基酸殘基的有23個(gè)序列，占3%；>2 000個(gè)氨基酸殘基的序列有0個(gè)(圖1)。

2.3 分泌組蛋白的胞外酶數(shù)據(jù)庫分析

將940個(gè)蛋白序列與The CAZymes Analysis Toolkit (CAT)軟件包進(jìn)行比對(duì)，獲得注釋的碳水化合物活性酶家族總數(shù)為185個(gè)。其中，碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding modules，CBM)為40個(gè)，占22%；碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CE)為23個(gè)，占12%；糖苷水解酶(glucoside hydrolases，GH)為92個(gè)，占50%；糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，GT)為4個(gè)，占2%；多糖裂解酶(polysaccharide lyases，PL)為2個(gè)，占1%；輔助功能(auxiliary activities，AA)為24個(gè)，占13%(圖2)。而CBM中又分別歸類于11個(gè)基因家族；CE的23個(gè)基因歸類為6個(gè)基因家族；GH的92個(gè)基因歸類于32個(gè)基因家族；GT 4個(gè)基因歸類為3個(gè)基因家庭，PL則為2個(gè)家族，而AA的24個(gè)基因歸類于7個(gè)家族(表1)。

圖2 球孢白僵菌分泌蛋白中的六類碳水化合物活性酶分析Fig.2 Analysis of six carbohydvate-active enzymes in the Beauveria bassiana predicted secretome

2.4 分泌組蛋白的半胱氨酸含量和多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列分析

由圖3可知，共得到516個(gè)含有高半胱氨酸(≥ 6)含量的蛋白。將含有高半胱氨酸含量的蛋白序列進(jìn)行多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列分析，得到137個(gè)含有多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列(≥ 9)的蛋白。

2.5 病原寄主互作數(shù)據(jù)庫分析

將137個(gè)蛋白序列與PHI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，共有129個(gè)蛋白在PHI數(shù)據(jù)中獲得注釋。其中，10個(gè)蛋白被證明缺失后會(huì)導(dǎo)致完全失去致病性，占8%，64個(gè)蛋白被證明缺失后會(huì)造成致病力減弱，占50%，推測(cè)為致病因子；11個(gè)蛋白已被證明是植物無毒效應(yīng)因子，占8%；33個(gè)蛋白則被認(rèn)為是不影響病原的致病力，占26%(表2)。因而，作為候選效應(yīng)因子的基因共89個(gè)，其中包括11個(gè)植物無毒效應(yīng)因子、64個(gè)致病力減弱基因，10個(gè)致病力喪失基因和4個(gè)混合型基因(表2)。

圖3 940個(gè)球孢白僵菌分泌蛋白的半胱氨酸殘基數(shù)量分布Fig.3 Number of cysteine of the 940 Beauveria bassiana secretome genes

編號(hào)Code缺失后的致病力Mutant pathogenicity蛋白數(shù)量Number of proteins所占比例Percentage/%1失去致病性 Loss of pathogenicity1082毒力減弱Reduced virulence64503混合型Mixed outcome9(4)74效應(yīng)因子 Effectors1185不影響病原的致病力Unaffected pathogenicity33266毒力增強(qiáng)Increased virulence21總計(jì)Total129100

注：*表示混合型蛋白中包含失去致病性或效應(yīng)因子的4個(gè)蛋白，其歸屬于倏選效應(yīng)因子。

Note:*indicates four proteins in the mixed outcome type, which are classified as candidate factors by losing their pathogenicity oreffectors.

2.6 候選致病相關(guān)效應(yīng)因子的確定

一般的效應(yīng)因子都是小分子蛋白，因此，將上述獲得的89個(gè)基因序列進(jìn)行長度篩選，去除大于300個(gè)氨基酸的蛋白序列。剩余的18個(gè)基因序列被認(rèn)為是候選致病相關(guān)效應(yīng)因子(表3)。其中有11個(gè)是假定蛋白，其余分別為胞外蛋白、細(xì)胞壁蛋白、幾丁質(zhì)酶蛋白等。

表3 球孢白僵菌候選效應(yīng)因子Table 3 Summary of putative effectors in Beauveria bassiana

3 討論

周曉罡等[29]運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)馬鈴薯晚疫病菌全基因組的22 658個(gè)蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有671個(gè)分泌蛋白。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)球孢白僵菌分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，從球孢白僵菌基因組10 364個(gè)蛋白進(jìn)行篩選分析，最后得到940個(gè)分泌蛋白。碳水化合物活性酶家族基因在病原真菌的致病性中起重要作用，Xiao等[8]從球孢白僵菌全基因組中共分析到145個(gè)GH，而本研究從分泌蛋白中共分析到92個(gè)GH，故推測(cè)有53個(gè)GH可能為非分泌蛋白。昆蟲病原真菌一般缺少GH6、GH7、GH12、GH45、GH61等纖維素酶及GH11、GH30、GH51、GH53、GH62、GH67、GH115等細(xì)胞壁降解酶[8]。而本研究分析顯示，球孢白僵菌中GH12和GH45各有1個(gè)，這2個(gè)纖維素酶功能尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前，已經(jīng)歸納出效應(yīng)子的一些分析特征[14-16]，但依照不同的標(biāo)準(zhǔn)分析可能得出不同的結(jié)果。閆麗斌等[17]基于對(duì)玉米大斑病菌全基因組序列進(jìn)行分泌蛋白的篩選，繼而對(duì)其蛋白半胱氨酸含量、信號(hào)肽長度及冗余性分析，獲得了60個(gè)候選效應(yīng)因子。陳琦光等[30]利用blastp 工具與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析。而本研究在此基礎(chǔ)上，將獲得的137個(gè)蛋白序列進(jìn)一步與PHI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，且保留了小于300個(gè)氨基酸序列的蛋白作為最后的候選效應(yīng)子，最后得到18個(gè)候選效應(yīng)子。本研究通過與PHI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步將非致病性的蛋白剔除，通過對(duì)940個(gè)分泌蛋白作進(jìn)一步篩選，剩余的18個(gè)蛋白序列被認(rèn)為是候選致病相關(guān)效應(yīng)因子。Cen等[28]研究發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)子LysM通過攻破昆蟲的免疫反應(yīng)而起致病作用，本研究也篩選到了該效應(yīng)子，其含有6個(gè)半胱氨酸，證明通過本方法可以有效篩選出效應(yīng)子。本研究篩選到的18個(gè)候選效應(yīng)子中大多數(shù)是假定蛋白，其余為胞外蛋白、細(xì)胞壁蛋白、幾丁質(zhì)酶蛋白等，這與閆麗斌等[17]的結(jié)果相似。本研究在篩選過程中使用了PHI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，這些基因在球孢白僵菌對(duì)昆蟲的致病相關(guān)過程中的具體功能還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)球孢白僵菌基因組的篩選，共獲得940個(gè)分泌蛋白，獲得注釋的碳水化合物活性酶家族共185個(gè)。將940個(gè)蛋白序列進(jìn)行半胱氨酸含量及多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列分析，共得到516個(gè)含有高半胱氨酸(≥ 6)含量的蛋白和137個(gè)含有多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列(≥ 9)的蛋白；病原寄主互作數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到89個(gè)蛋白，去除大于300的氨基酸序列，最終得到18個(gè)候選致病相關(guān)的效應(yīng)因子。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究球孢白僵菌的效應(yīng)子功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。