張桂蓮 趙 瑞 劉逸童 唐文幫,*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖南 長沙 410128；2 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南 長沙 410128；3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室, 湖南 長沙 410128)

水稻(OryzasativaL.)是世界上最主要的糧食作物之一，據(jù)統(tǒng)計，世界上約有一半以上的人口以水稻為主食[1]。水稻起源于低緯度地區(qū)，水稻喜高溫、多濕、短日照，但溫度過高對水稻生長發(fā)育會產(chǎn)生不利的影響[2]。近年來由于全球氣候變暖，高溫天氣發(fā)生頻率越來越高，特別是我國長江中下游稻區(qū)，7-8月份高溫天氣在近幾年已演變?yōu)槌B(tài)天氣，而此時為長江中下游早稻灌漿結(jié)實期和中稻抽穗揚花期，高溫嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。因此，開展水稻耐熱性分子機制研究，加快高溫鈍感型水稻優(yōu)良品種的選育，對保障國家的糧食安全生產(chǎn)具有重要意義。

近年來隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，大量研究者應(yīng)用該技術(shù)對水稻逆境脅迫的分子機制進行了研究。如Lin等[5]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定了水稻灌漿成熟期應(yīng)答高溫?zé)岷Φ?4個差異表達蛋白的生物學(xué)功能；廖江林等[6]鑒定了水稻籽粒應(yīng)答灌漿初期高溫脅迫過程中的25個差異表達蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其主要參與氧化作用、能量代謝、生物合成、應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程。同位素相對和絕對定量標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)是近幾年發(fā)展起來的一種新型定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，它可以同時對多種不同樣本和不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表達的質(zhì)和量的變化進行比較研究[7-9]。如Neilson等[10]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)獲得了85個與低溫應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，其主要參與能量代謝、生物合成、轉(zhuǎn)運、光合作用等生物學(xué)過程；Zhang等[11]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)獲得了32個與水稻乳熟期高溫應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的差異表達蛋白，主要分布于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化、應(yīng)激防御、轉(zhuǎn)運、能量代謝、生物合成等功能群；黃小平等[12]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)獲得了36個與水稻籽粒灌漿期高溫應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的差異表達蛋白，其主要參與物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)運、光合作用、能量代謝、逆境應(yīng)答等生物學(xué)過程。

水稻開花期的雄性器官對高溫反應(yīng)最為敏感，開花期遭遇高溫會影響水稻開花受精，直接導(dǎo)致結(jié)實率下降，產(chǎn)量降低[13-15]。但目前關(guān)于水稻雄性器官(花藥)響應(yīng)高溫脅迫的分子機制研究較少，因此本研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選高溫下水稻花藥差異蛋白，并通過生物信息學(xué)統(tǒng)計方法對高溫下水稻花藥差異蛋白進行分析，以期從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度分析水稻花藥熱脅迫的應(yīng)答機制，為揭示水稻耐熱性的分子機理奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為耐熱水稻品系996、熱敏感水稻品系4628，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。二者生育期基本一致，但耐熱性具有顯著差異，在異常高溫條件下種植，前者的結(jié)實率為66.31%，結(jié)實性和產(chǎn)量均未受明顯影響，而后者結(jié)實率僅為30.11%[16]。

1.2 方法

采用盆栽試驗，于2014年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所網(wǎng)室內(nèi)進行。4月20日播種，5月20日移栽，每盆移栽3穴，每穴1粒谷苗，共60盆，于水稻抽穗當(dāng)日，移入人工氣候室進行高溫處理(8:00-17:00，37℃，17:00-8:00，30℃)和適溫處理(8:00-17:00，30℃，17:00-8:00，25℃)。于處理第3天上午取花藥裝入1.5 mL離心管，用錫箔紙包裹后放入液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆?，每處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。并于第3天取花藥測定丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量和相對電導(dǎo)率，其中MDA含量測定參照李合生等[17]的方法，花藥相對電導(dǎo)率參照張憲政[18]的方法。

1.3 iTRAQ標(biāo)記試驗

采用TCA-丙酮-超聲法[19]提取花藥中蛋白質(zhì)，采用考馬斯亮蘭法[17]測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE檢測合格后，每個樣品取蛋白100 μg于1.5 mL離心管中。按照美國AB Sciex公司生產(chǎn)的iTRAQ? Reagent 8 Plex Multi-plex 試劑盒說明書進行樣品處理和標(biāo)記?；旌蠘?biāo)記后的樣品用C18色譜柱進行分級，隨后用NCS3500系統(tǒng)高效液相色譜儀(戴安公司，德國)和Q Exactive質(zhì)譜儀(Thero scientifi公司，美國)進行液相分離和質(zhì)譜分析。

1.4 差異蛋白的選擇

某個蛋白的差異倍數(shù)(fold change)>1.50或<0.67，且統(tǒng)計檢驗P<0.05即可認為是上調(diào)或下調(diào)差異蛋白。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用GO對鑒定差異蛋白進行功能分析，GO分析借助在線工具agriGO (http://bioinfo.cau/edu/cn/agriGO)進行，采用hypergeometric檢測方法，P<0.05的GO term即為統(tǒng)計上顯著富集的GO Term。利用MapMan軟件對差異蛋白進行主要通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達蛋白鑒定結(jié)果

本試驗共獲得肽段(unique peptide) 37 463個，其中與數(shù)據(jù)庫相匹配的肽段數(shù)有33 852個。由表1可知，鑒定的蛋白質(zhì)大部分集中在包含1～7個肽段數(shù)，共1 257個蛋白，占鑒定蛋白的89.59%，8個以上肽段數(shù)的蛋白質(zhì)所占比例較少，僅146個，占鑒定蛋白的10.41%。

鑒定出的蛋白總數(shù)為6 076個，其中差異倍數(shù)在1.5倍以上的蛋白數(shù)有957個。由表2可知，覆蓋率在10%以下的蛋白占鑒定總蛋白的30.08%，覆蓋率在20%～60%的蛋白占鑒定總蛋白的44.40%，覆蓋率在60%以上的蛋白占鑒定總蛋白的6.56%。在996高溫-996適溫比較組中表達上調(diào)蛋白110個，表達下調(diào)蛋白256個，共366個；在4628高溫-4628適溫比較組中表達上調(diào)蛋白73個，表達下調(diào)蛋白187個，共260個；在996高溫-4628高溫比較組中表達上調(diào)蛋白119個，表達下調(diào)蛋白255個，共374個；在996適溫-4628適溫比較中表達上調(diào)蛋白164個，表達下調(diào)蛋白237個，共401個(表2)。

2.2 差異蛋白生物信息功能分析

利用GO對差異蛋白進行功能富集分析，結(jié)果顯示，996高溫-996適溫比較組差異表達蛋白主要集中在代謝過程和細胞過程，分別占鑒定蛋白總數(shù)的56.12%和45.58%；主要涉及胞內(nèi)部分、細胞器和細胞，其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的71.43%，71.43%和55.44%；這些差異蛋白的分子功能主要表現(xiàn)為催化活性和參與綁定，分別占鑒定蛋白總數(shù)的46.26%和45.24%。4628高溫-4628適溫比較組差異表達蛋白主要集中在代謝過程、細胞過程、初級代謝過程和細胞代謝過程，分別占鑒定蛋白總數(shù)的47.6%、45.79%、40.19%和36.92%；主要集中在細胞膜、細胞膜部分、大分子復(fù)合物和細胞器部分，其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的22.89%、19.16%、15.89%和15.42%；其分子功能主要集中在催化活性、綁定和水解酶活性，其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的49.07%、45.33%、24.30%。

表1 鑒定蛋白的肽段數(shù)及比例Table 1 The number and percentage of identified peptides

注：996HT-996OT：996高溫-996適溫；4628H7-462807：4628高溫-4628適溫；996HT-4628HT：996高溫-4628高溫；99607-462807：996適溫-4628適溫。下同。

Note：996HT-996OT：996 high temperature-996 optimal temperature. 4628HT-4628OT：4628 high temperature-4628 optimal temperature. 996HT-4628HT：996 high temperature-4628 high temperature. 996OT-4628OT：996 optimal temperature-4628 optimal temperature. The same as following.

表2 鑒定蛋白覆蓋率分布Table 2 The distribution for coverage percentage of identified proteins

996高溫-4628高溫比較組差異表達蛋白主要集中于細胞過程、代謝過程、細胞代謝過程和初級代謝過程，分別占鑒定蛋白總數(shù)的51.19%、43.34%、36.86%和35.15%；主要集中于細胞膜、細胞膜部分、細胞部分和細胞器部分，其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的29.35%、24.57%、20.14%和15.36%；在分子功能方面差異蛋白主要集中在催化活性和綁定，其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的56.70%和45.73%。996適溫-4628適溫比較組差異表達蛋白主要集中于細胞過程、代謝過程、細胞代謝過程和初級代謝過程，分別占鑒定蛋白總數(shù)的48.21%、40.39%、32.90%和32.25%；主要集中于細胞膜、細胞膜部分、細胞器部分和大分子復(fù)合物，其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的32.57%、26.71%、16.61%和16.29%；在分子功能方面差異蛋白主要集中于催化活性和綁定，其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的52.12%和44.63%。

2.3 花藥差異蛋白通路分析

選取996高溫-996適溫和4628高溫-4628適溫2個比較組的626個差異表達蛋白，利用MapMan軟件進行主要通路分析。由表3可知，有2個轉(zhuǎn)錄因子參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng)，1個來源于bZIP家族基因，表現(xiàn)為下調(diào)，1個來源于DOF家族基因，表現(xiàn)為上調(diào)；有18個熱激蛋白(heat shoct proteins，HSPs)基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng)，8個自于sHSPs基因，其中2個來自于HSP70s，1個來自于HSP100s，7個未知功能，高溫下大部分熱激蛋白表達上調(diào)。有7個植物激素相關(guān)基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng)，這些基因主要與生長素、乙烯、脫落酸(abscisic acid，ABA)的代謝與信號傳導(dǎo)相關(guān)。在2個生長素基因中，1個上調(diào)，1個下調(diào)，在乙烯、ABA基因中均表現(xiàn)為下調(diào)。熱激響應(yīng)的蛋白激酶主要包括LRR家族、G蛋白、鈣離子相關(guān)蛋白基因、光響應(yīng)蛋白、糖和營養(yǎng)激酶基因等，9個鈣離子相關(guān)蛋白基因中，2個上調(diào)，7個下調(diào)；5個G蛋白基因中，1個上調(diào)，4個下調(diào)；3個LRR家族，1個上調(diào)，2個下調(diào)；1個光響應(yīng)蛋白上調(diào)。有10個活性氧(reactive oxygen species，ROS)相關(guān)基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng)，主要包括過氧化物酶(peroxidase，POD)、硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredoxin peroxidase，TPx)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)、谷氧還蛋白，5個Trx基因中，2個上調(diào)，3個下調(diào)；3個POD基因中，2個上調(diào)，1下調(diào)；1個谷氧還蛋白基因上調(diào)；1個TPx基因下調(diào)。在次生代謝通路，受高溫顯著調(diào)控的次生代謝相關(guān)基因主要參與了苯丙素類、酚類、木質(zhì)素和木青素、黃酮醇、莽草酸途徑等的合成代謝，大部分次生代謝相關(guān)基因表達下調(diào)。

表3 高溫下差異表達蛋白Table 3 The differentially expressed proteins under high temperature treatment

表3(續(xù))

表3(續(xù))

注：差異倍數(shù)表示996HT-996OT比較組與4628HT-4628OT比較組的差異倍數(shù)。

Note: Fold changes mean the fold changes of 996HT-996OT comparison groups and 4628HT-4628OT comparison groups.

2.4 差異表達蛋白質(zhì)對應(yīng)的基因表達模式驗證

隨機選擇6個差異蛋白對應(yīng)的基因進行表達水平的分析，結(jié)果表明，在高溫脅迫下，差異蛋白和基因表達變化趨勢基本一致(圖1)，表明通過iTRAQ差異標(biāo)記結(jié)合高效液相色譜技術(shù)鑒定并定量的蛋白質(zhì)組結(jié)果可靠性強。

圖1 差異表達蛋白質(zhì)及其編碼基因的表達模式Fig.1 Expression pattern of the differentially expressed protein and its coding gene

2.5 高溫下水稻花藥MDA含量和相對電導(dǎo)率的變化

由圖2-A可知，高溫脅迫下水稻996和4628花藥MDA含量均顯著增加，且4628的MDA含量增加幅度高于996。與適溫相比，高溫脅迫下996和4628花藥的MDA含量分別增加了47.98%和55.64%。由圖2-B可知，與MDA變化的趨勢相一致，高溫脅迫下，996和4628花藥相對電導(dǎo)率均顯著增加，且4628花藥的相對電導(dǎo)率增加幅度大于996。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note: Different small letters indicate significant difference at 0.05 level.圖2 高溫脅迫下水稻花藥MDA含量(A)和 相對電導(dǎo)率(B)的變化Fig.2 The change of MDA content(A)and relative conductivity(B) of rice anther under high temperature stress

3 討論

HSPs是一類功能蛋白，當(dāng)植物生長遭受高溫脅迫時,會立即產(chǎn)生HSPs以響應(yīng)脅迫，并作為分子伴侶維持蛋白結(jié)構(gòu)和生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這有助于清除過剩的ROS,對細胞的保護起著非常重要的作用[20]。大量研究表明，HSPs在逆境脅迫下可誘導(dǎo)表達[21-22]，如廖江林等[6]研究發(fā)現(xiàn)，水稻灌漿期高溫能誘導(dǎo)HSPs上調(diào)表達；黃小平等[12]應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)檢測水稻應(yīng)答夜間高溫脅迫時發(fā)現(xiàn)，HSPs上調(diào)表達；郭秀林等[23]研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫能顯著誘導(dǎo)耐熱小麥品種熱激蛋白Hsp70和Hsp16.9基因的表達。本研究檢測到18個HSPs基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng)，且高溫脅迫下大部分HSPs基因表達上調(diào)，在996高溫-996適溫比較組中上調(diào)表達量高于4628高溫-4628適溫比較組，表明高溫脅迫能誘導(dǎo)水稻花藥HSPs上調(diào)表達，這與前人研究結(jié)果一致。

在正常的生理條件下，植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除維持一種動態(tài)平衡狀態(tài)，但在逆境脅迫下由于代謝障礙，ROS增加，高水平的ROS可使膜脂過氧化及大分子蛋白質(zhì)之間聚合,破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[24]。過氧化物酶是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶[25-26]。研究表明逆境脅迫下過氧化物酶基因表達量上調(diào)，過表達過氧化物酶基因可增強玉米抗氧化能力[27]。谷氧還蛋白(glutaredoxin, GRX)是生物體中依賴于谷胱甘肽的小分子氧化還原酶類，在逆境下可通過改變其氧化還原狀態(tài)以維持蛋白質(zhì)活性，避免植物遭受氧化傷害[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下，水稻花藥中有2個過氧化物酶基因、2個硫氧還蛋白基因和1個谷氧還蛋白基因表達上調(diào)，且在996高溫-996適溫比較組中上調(diào)表達量高于4628高溫-4628適溫比較組，表明水稻花藥受到高溫脅迫時會誘導(dǎo)一些抗氧化蛋白基因上調(diào)表達來消除ROS，從而保護細胞膜系統(tǒng)，減輕其ROS或其他過氧化物自由基的傷害。同時，花藥中MDA含量和相對電導(dǎo)率的變化也驗證了高溫下耐熱品系996花藥細胞膜受傷害程度小于熱敏感品系4628。

轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用，研究表明水稻基因組被注釋的轉(zhuǎn)錄因子至少有1 930 個，共分為63個轉(zhuǎn)錄因子家族[29]。在水稻基因組中，89個OsbZIP基因被分為11組[30]。研究發(fā)現(xiàn)，只有OsbZIP45能同時被干旱、鹽和冷害脅迫誘導(dǎo)高水平表達,而OsbZIP12、OsbZIP60和OsbZIP66只被干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達[31]。本研究篩選出2個轉(zhuǎn)錄因子參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng)，1個來源于bZIP家族基因，表現(xiàn)為下調(diào)，1個來源于DOF家族基因，表現(xiàn)為上調(diào)，說明bZIP家族基因主要參與了水稻花藥對高溫響應(yīng)的負調(diào)控，而DOF家族基因可能在水稻花藥對高溫脅迫響應(yīng)中起正調(diào)控作用。

次生代謝是植物體內(nèi)重要的生理代謝，且易受環(huán)境因子影響。研究表明，逆境脅迫會影響植物體內(nèi)苯丙烷類代謝和花青素的生物合成[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，12 個次生代謝相關(guān)基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng),在高溫脅迫下這些基因大部分下調(diào)表達, 表明高溫脅迫下，水稻花藥中苯丙素類、酚類、木質(zhì)素和木青素、黃酮醇、莽草酸途徑等次生代謝合成受到抑制。

4 結(jié)論

本研究共篩選到957個水稻差異表達蛋白，功能分析表明其主要集中于代謝過程和細胞過程，在細胞組成方面主要分布于胞內(nèi)部分、細胞器和細胞，分子功能主要涉及催化活性和綁定等。通路分析顯示，高溫下花藥中的熱激蛋白基因大部分表達上調(diào)，而與植物激素、信號傳導(dǎo)和次生代謝相關(guān)基因大部分下調(diào)。下一步可針對水稻一些差異表達基因進行生物學(xué)功能分析。