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        基于iTRAQ技術(shù)的不同耐熱性水稻花藥差異蛋白分析

        2019-04-18 09:36:26張桂蓮劉逸童唐文幫
        核農(nóng)學(xué)報(bào) 2019年4期
        關(guān)鍵詞:花藥高溫蛋白質(zhì)

        張桂蓮 趙 瑞 劉逸童 唐文幫,*

        (1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖南 長沙 410128;2 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南 長沙 410128;3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410128)

        水稻(OryzasativaL.)是世界上最主要的糧食作物之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),世界上約有一半以上的人口以水稻為主食[1]。水稻起源于低緯度地區(qū),水稻喜高溫、多濕、短日照,但溫度過高對水稻生長發(fā)育會產(chǎn)生不利的影響[2]。近年來由于全球氣候變暖,高溫天氣發(fā)生頻率越來越高,特別是我國長江中下游稻區(qū),7-8月份高溫天氣在近幾年已演變?yōu)槌B(tài)天氣,而此時(shí)為長江中下游早稻灌漿結(jié)實(shí)期和中稻抽穗揚(yáng)花期,高溫嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。因此,開展水稻耐熱性分子機(jī)制研究,加快高溫鈍感型水稻優(yōu)良品種的選育,對保障國家的糧食安全生產(chǎn)具有重要意義。

        近年來隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,大量研究者應(yīng)用該技術(shù)對水稻逆境脅迫的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。如Lin等[5]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定了水稻灌漿成熟期應(yīng)答高溫?zé)岷Φ?4個(gè)差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能;廖江林等[6]鑒定了水稻籽粒應(yīng)答灌漿初期高溫脅迫過程中的25個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)其主要參與氧化作用、能量代謝、生物合成、應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程。同位素相對和絕對定量標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)是近幾年發(fā)展起來的一種新型定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),它可以同時(shí)對多種不同樣本和不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)和量的變化進(jìn)行比較研究[7-9]。如Neilson等[10]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)獲得了85個(gè)與低溫應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì),其主要參與能量代謝、生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、光合作用等生物學(xué)過程;Zhang等[11]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)獲得了32個(gè)與水稻乳熟期高溫應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白,主要分布于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化、應(yīng)激防御、轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝、生物合成等功能群;黃小平等[12]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)獲得了36個(gè)與水稻籽粒灌漿期高溫應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白,其主要參與物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)、光合作用、能量代謝、逆境應(yīng)答等生物學(xué)過程。

        水稻開花期的雄性器官對高溫反應(yīng)最為敏感,開花期遭遇高溫會影響水稻開花受精,直接導(dǎo)致結(jié)實(shí)率下降,產(chǎn)量降低[13-15]。但目前關(guān)于水稻雄性器官(花藥)響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制研究較少,因此本研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選高溫下水稻花藥差異蛋白,并通過生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對高溫下水稻花藥差異蛋白進(jìn)行分析,以期從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度分析水稻花藥熱脅迫的應(yīng)答機(jī)制,為揭示水稻耐熱性的分子機(jī)理奠定一定的理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        供試材料為耐熱水稻品系996、熱敏感水稻品系4628,均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。二者生育期基本一致,但耐熱性具有顯著差異,在異常高溫條件下種植,前者的結(jié)實(shí)率為66.31%,結(jié)實(shí)性和產(chǎn)量均未受明顯影響,而后者結(jié)實(shí)率僅為30.11%[16]。

        1.2 方法

        采用盆栽試驗(yàn),于2014年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行。4月20日播種,5月20日移栽,每盆移栽3穴,每穴1粒谷苗,共60盆,于水稻抽穗當(dāng)日,移入人工氣候室進(jìn)行高溫處理(8:00-17:00,37℃,17:00-8:00,30℃)和適溫處理(8:00-17:00,30℃,17:00-8:00,25℃)。于處理第3天上午取花藥裝入1.5 mL離心管,用錫箔紙包裹后放入液氮中速凍,-80℃保存?zhèn)溆?,每處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。并于第3天取花藥測定丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量和相對電導(dǎo)率,其中MDA含量測定參照李合生等[17]的方法,花藥相對電導(dǎo)率參照張憲政[18]的方法。

        1.3 iTRAQ標(biāo)記試驗(yàn)

        采用TCA-丙酮-超聲法[19]提取花藥中蛋白質(zhì),采用考馬斯亮蘭法[17]測定蛋白濃度,經(jīng)SDS-PAGE檢測合格后,每個(gè)樣品取蛋白100 μg于1.5 mL離心管中。按照美國AB Sciex公司生產(chǎn)的iTRAQ? Reagent 8 Plex Multi-plex 試劑盒說明書進(jìn)行樣品處理和標(biāo)記?;旌蠘?biāo)記后的樣品用C18色譜柱進(jìn)行分級,隨后用NCS3500系統(tǒng)高效液相色譜儀(戴安公司,德國)和Q Exactive質(zhì)譜儀(Thero scientifi公司,美國)進(jìn)行液相分離和質(zhì)譜分析。

        1.4 差異蛋白的選擇

        某個(gè)蛋白的差異倍數(shù)(fold change)>1.50或<0.67,且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P<0.05即可認(rèn)為是上調(diào)或下調(diào)差異蛋白。

        1.5 生物信息學(xué)分析

        利用GO對鑒定差異蛋白進(jìn)行功能分析,GO分析借助在線工具agriGO (http://bioinfo.cau/edu/cn/agriGO)進(jìn)行,采用hypergeometric檢測方法,P<0.05的GO term即為統(tǒng)計(jì)上顯著富集的GO Term。利用MapMan軟件對差異蛋白進(jìn)行主要通路分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果

        本試驗(yàn)共獲得肽段(unique peptide) 37 463個(gè),其中與數(shù)據(jù)庫相匹配的肽段數(shù)有33 852個(gè)。由表1可知,鑒定的蛋白質(zhì)大部分集中在包含1~7個(gè)肽段數(shù),共1 257個(gè)蛋白,占鑒定蛋白的89.59%,8個(gè)以上肽段數(shù)的蛋白質(zhì)所占比例較少,僅146個(gè),占鑒定蛋白的10.41%。

        鑒定出的蛋白總數(shù)為6 076個(gè),其中差異倍數(shù)在1.5倍以上的蛋白數(shù)有957個(gè)。由表2可知,覆蓋率在10%以下的蛋白占鑒定總蛋白的30.08%,覆蓋率在20%~60%的蛋白占鑒定總蛋白的44.40%,覆蓋率在60%以上的蛋白占鑒定總蛋白的6.56%。在996高溫-996適溫比較組中表達(dá)上調(diào)蛋白110個(gè),表達(dá)下調(diào)蛋白256個(gè),共366個(gè);在4628高溫-4628適溫比較組中表達(dá)上調(diào)蛋白73個(gè),表達(dá)下調(diào)蛋白187個(gè),共260個(gè);在996高溫-4628高溫比較組中表達(dá)上調(diào)蛋白119個(gè),表達(dá)下調(diào)蛋白255個(gè),共374個(gè);在996適溫-4628適溫比較中表達(dá)上調(diào)蛋白164個(gè),表達(dá)下調(diào)蛋白237個(gè),共401個(gè)(表2)。

        2.2 差異蛋白生物信息功能分析

        利用GO對差異蛋白進(jìn)行功能富集分析,結(jié)果顯示,996高溫-996適溫比較組差異表達(dá)蛋白主要集中在代謝過程和細(xì)胞過程,分別占鑒定蛋白總數(shù)的56.12%和45.58%;主要涉及胞內(nèi)部分、細(xì)胞器和細(xì)胞,其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的71.43%,71.43%和55.44%;這些差異蛋白的分子功能主要表現(xiàn)為催化活性和參與綁定,分別占鑒定蛋白總數(shù)的46.26%和45.24%。4628高溫-4628適溫比較組差異表達(dá)蛋白主要集中在代謝過程、細(xì)胞過程、初級代謝過程和細(xì)胞代謝過程,分別占鑒定蛋白總數(shù)的47.6%、45.79%、40.19%和36.92%;主要集中在細(xì)胞膜、細(xì)胞膜部分、大分子復(fù)合物和細(xì)胞器部分,其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的22.89%、19.16%、15.89%和15.42%;其分子功能主要集中在催化活性、綁定和水解酶活性,其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的49.07%、45.33%、24.30%。

        表1 鑒定蛋白的肽段數(shù)及比例Table 1 The number and percentage of identified peptides

        注:996HT-996OT:996高溫-996適溫;4628H7-462807:4628高溫-4628適溫;996HT-4628HT:996高溫-4628高溫;99607-462807:996適溫-4628適溫。下同。

        Note:996HT-996OT:996 high temperature-996 optimal temperature. 4628HT-4628OT:4628 high temperature-4628 optimal temperature. 996HT-4628HT:996 high temperature-4628 high temperature. 996OT-4628OT:996 optimal temperature-4628 optimal temperature. The same as following.

        表2 鑒定蛋白覆蓋率分布Table 2 The distribution for coverage percentage of identified proteins

        996高溫-4628高溫比較組差異表達(dá)蛋白主要集中于細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞代謝過程和初級代謝過程,分別占鑒定蛋白總數(shù)的51.19%、43.34%、36.86%和35.15%;主要集中于細(xì)胞膜、細(xì)胞膜部分、細(xì)胞部分和細(xì)胞器部分,其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的29.35%、24.57%、20.14%和15.36%;在分子功能方面差異蛋白主要集中在催化活性和綁定,其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的56.70%和45.73%。996適溫-4628適溫比較組差異表達(dá)蛋白主要集中于細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞代謝過程和初級代謝過程,分別占鑒定蛋白總數(shù)的48.21%、40.39%、32.90%和32.25%;主要集中于細(xì)胞膜、細(xì)胞膜部分、細(xì)胞器部分和大分子復(fù)合物,其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的32.57%、26.71%、16.61%和16.29%;在分子功能方面差異蛋白主要集中于催化活性和綁定,其差異蛋白分別占鑒定蛋白總數(shù)的52.12%和44.63%。

        2.3 花藥差異蛋白通路分析

        選取996高溫-996適溫和4628高溫-4628適溫2個(gè)比較組的626個(gè)差異表達(dá)蛋白,利用MapMan軟件進(jìn)行主要通路分析。由表3可知,有2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng),1個(gè)來源于bZIP家族基因,表現(xiàn)為下調(diào),1個(gè)來源于DOF家族基因,表現(xiàn)為上調(diào);有18個(gè)熱激蛋白(heat shoct proteins,HSPs)基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng),8個(gè)自于sHSPs基因,其中2個(gè)來自于HSP70s,1個(gè)來自于HSP100s,7個(gè)未知功能,高溫下大部分熱激蛋白表達(dá)上調(diào)。有7個(gè)植物激素相關(guān)基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng),這些基因主要與生長素、乙烯、脫落酸(abscisic acid,ABA)的代謝與信號傳導(dǎo)相關(guān)。在2個(gè)生長素基因中,1個(gè)上調(diào),1個(gè)下調(diào),在乙烯、ABA基因中均表現(xiàn)為下調(diào)。熱激響應(yīng)的蛋白激酶主要包括LRR家族、G蛋白、鈣離子相關(guān)蛋白基因、光響應(yīng)蛋白、糖和營養(yǎng)激酶基因等,9個(gè)鈣離子相關(guān)蛋白基因中,2個(gè)上調(diào),7個(gè)下調(diào);5個(gè)G蛋白基因中,1個(gè)上調(diào),4個(gè)下調(diào);3個(gè)LRR家族,1個(gè)上調(diào),2個(gè)下調(diào);1個(gè)光響應(yīng)蛋白上調(diào)。有10個(gè)活性氧(reactive oxygen species,ROS)相關(guān)基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng),主要包括過氧化物酶(peroxidase,POD)、硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredoxin peroxidase,TPx)、硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)、谷氧還蛋白,5個(gè)Trx基因中,2個(gè)上調(diào),3個(gè)下調(diào);3個(gè)POD基因中,2個(gè)上調(diào),1下調(diào);1個(gè)谷氧還蛋白基因上調(diào);1個(gè)TPx基因下調(diào)。在次生代謝通路,受高溫顯著調(diào)控的次生代謝相關(guān)基因主要參與了苯丙素類、酚類、木質(zhì)素和木青素、黃酮醇、莽草酸途徑等的合成代謝,大部分次生代謝相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。

        表3 高溫下差異表達(dá)蛋白Table 3 The differentially expressed proteins under high temperature treatment

        表3(續(xù))

        表3(續(xù))

        注:差異倍數(shù)表示996HT-996OT比較組與4628HT-4628OT比較組的差異倍數(shù)。

        Note: Fold changes mean the fold changes of 996HT-996OT comparison groups and 4628HT-4628OT comparison groups.

        2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)對應(yīng)的基因表達(dá)模式驗(yàn)證

        隨機(jī)選擇6個(gè)差異蛋白對應(yīng)的基因進(jìn)行表達(dá)水平的分析,結(jié)果表明,在高溫脅迫下,差異蛋白和基因表達(dá)變化趨勢基本一致(圖1),表明通過iTRAQ差異標(biāo)記結(jié)合高效液相色譜技術(shù)鑒定并定量的蛋白質(zhì)組結(jié)果可靠性強(qiáng)。

        圖1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)及其編碼基因的表達(dá)模式Fig.1 Expression pattern of the differentially expressed protein and its coding gene

        2.5 高溫下水稻花藥MDA含量和相對電導(dǎo)率的變化

        由圖2-A可知,高溫脅迫下水稻996和4628花藥MDA含量均顯著增加,且4628的MDA含量增加幅度高于996。與適溫相比,高溫脅迫下996和4628花藥的MDA含量分別增加了47.98%和55.64%。由圖2-B可知,與MDA變化的趨勢相一致,高溫脅迫下,996和4628花藥相對電導(dǎo)率均顯著增加,且4628花藥的相對電導(dǎo)率增加幅度大于996。

        注:不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note: Different small letters indicate significant difference at 0.05 level.圖2 高溫脅迫下水稻花藥MDA含量(A)和 相對電導(dǎo)率(B)的變化Fig.2 The change of MDA content(A)and relative conductivity(B) of rice anther under high temperature stress

        3 討論

        HSPs是一類功能蛋白,當(dāng)植物生長遭受高溫脅迫時(shí),會立即產(chǎn)生HSPs以響應(yīng)脅迫,并作為分子伴侶維持蛋白結(jié)構(gòu)和生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,這有助于清除過剩的ROS,對細(xì)胞的保護(hù)起著非常重要的作用[20]。大量研究表明,HSPs在逆境脅迫下可誘導(dǎo)表達(dá)[21-22],如廖江林等[6]研究發(fā)現(xiàn),水稻灌漿期高溫能誘導(dǎo)HSPs上調(diào)表達(dá);黃小平等[12]應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)檢測水稻應(yīng)答夜間高溫脅迫時(shí)發(fā)現(xiàn),HSPs上調(diào)表達(dá);郭秀林等[23]研究發(fā)現(xiàn),高溫脅迫能顯著誘導(dǎo)耐熱小麥品種熱激蛋白Hsp70和Hsp16.9基因的表達(dá)。本研究檢測到18個(gè)HSPs基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng),且高溫脅迫下大部分HSPs基因表達(dá)上調(diào),在996高溫-996適溫比較組中上調(diào)表達(dá)量高于4628高溫-4628適溫比較組,表明高溫脅迫能誘導(dǎo)水稻花藥HSPs上調(diào)表達(dá),這與前人研究結(jié)果一致。

        在正常的生理?xiàng)l件下,植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除維持一種動態(tài)平衡狀態(tài),但在逆境脅迫下由于代謝障礙,ROS增加,高水平的ROS可使膜脂過氧化及大分子蛋白質(zhì)之間聚合,破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[24]。過氧化物酶是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶[25-26]。研究表明逆境脅迫下過氧化物酶基因表達(dá)量上調(diào),過表達(dá)過氧化物酶基因可增強(qiáng)玉米抗氧化能力[27]。谷氧還蛋白(glutaredoxin, GRX)是生物體中依賴于谷胱甘肽的小分子氧化還原酶類,在逆境下可通過改變其氧化還原狀態(tài)以維持蛋白質(zhì)活性,避免植物遭受氧化傷害[28]。本研究發(fā)現(xiàn),高溫脅迫下,水稻花藥中有2個(gè)過氧化物酶基因、2個(gè)硫氧還蛋白基因和1個(gè)谷氧還蛋白基因表達(dá)上調(diào),且在996高溫-996適溫比較組中上調(diào)表達(dá)量高于4628高溫-4628適溫比較組,表明水稻花藥受到高溫脅迫時(shí)會誘導(dǎo)一些抗氧化蛋白基因上調(diào)表達(dá)來消除ROS,從而保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng),減輕其ROS或其他過氧化物自由基的傷害。同時(shí),花藥中MDA含量和相對電導(dǎo)率的變化也驗(yàn)證了高溫下耐熱品系996花藥細(xì)胞膜受傷害程度小于熱敏感品系4628。

        轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用,研究表明水稻基因組被注釋的轉(zhuǎn)錄因子至少有1 930 個(gè),共分為63個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[29]。在水稻基因組中,89個(gè)OsbZIP基因被分為11組[30]。研究發(fā)現(xiàn),只有OsbZIP45能同時(shí)被干旱、鹽和冷害脅迫誘導(dǎo)高水平表達(dá),而OsbZIP12、OsbZIP60和OsbZIP66只被干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[31]。本研究篩選出2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng),1個(gè)來源于bZIP家族基因,表現(xiàn)為下調(diào),1個(gè)來源于DOF家族基因,表現(xiàn)為上調(diào),說明bZIP家族基因主要參與了水稻花藥對高溫響應(yīng)的負(fù)調(diào)控,而DOF家族基因可能在水稻花藥對高溫脅迫響應(yīng)中起正調(diào)控作用。

        次生代謝是植物體內(nèi)重要的生理代謝,且易受環(huán)境因子影響。研究表明,逆境脅迫會影響植物體內(nèi)苯丙烷類代謝和花青素的生物合成[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn),12 個(gè)次生代謝相關(guān)基因參與了水稻花藥對高溫的響應(yīng),在高溫脅迫下這些基因大部分下調(diào)表達(dá), 表明高溫脅迫下,水稻花藥中苯丙素類、酚類、木質(zhì)素和木青素、黃酮醇、莽草酸途徑等次生代謝合成受到抑制。

        4 結(jié)論

        本研究共篩選到957個(gè)水稻差異表達(dá)蛋白,功能分析表明其主要集中于代謝過程和細(xì)胞過程,在細(xì)胞組成方面主要分布于胞內(nèi)部分、細(xì)胞器和細(xì)胞,分子功能主要涉及催化活性和綁定等。通路分析顯示,高溫下花藥中的熱激蛋白基因大部分表達(dá)上調(diào),而與植物激素、信號傳導(dǎo)和次生代謝相關(guān)基因大部分下調(diào)。下一步可針對水稻一些差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析。

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